兒童腹瀉病原體常用檢測方法研究進展*

約爾蘭姆·托合提，陸 妍，朱雨悅 綜述，金 玉△ 審校

1.南京大學醫學院，江蘇南京 210093；2.南京醫科大學附屬兒童醫院消化科，江蘇南京 210008

感染性腹瀉是指由病毒、細菌、真菌或寄生蟲引起的以腹瀉為主要臨床表現的胃腸道傳染病，其對兒童健康造成極大威脅[1]。據《柳葉刀》雜志報道，2019年腹瀉是5歲以下兒童死亡的第三大原因，占全球5歲以下兒童死亡人數的9.9%(95%CI：9.0%～28.0%)[2]。近3年全球新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染情況的相關研究表明，腹瀉是SARS-CoV-2感染患兒的常見臨床表現，并且從糞便排出病毒的時間可持續50 d[3-4]。因此，快速、準確地檢測引起腹瀉的病原體顯得尤其重要。早期診斷和治療可改善腹瀉患兒預后，降低醫療成本，而腹瀉病原體的快速檢測是感染性腹瀉早期診斷和合理用藥的基礎[5-7]。目前常見的腹瀉病原體檢測方法大致分為兩類，即傳統檢測方法和新型分子診斷方法。然而，這些方法的檢測效率因原理和目標的不同而有所差異，本文總結了目前臨床上常見的傳統和新型腹瀉病原體檢測方法，以期為臨床提供參考。

1 傳統檢測方法

1.1顯微鏡檢測 顯微鏡檢測又稱為鏡檢法、涂片法，臨床上主要用于疑似隱孢子蟲、藍氏賈第鞭毛蟲等寄生蟲感染患兒的實驗診斷[1,8]。鏡檢法的優勢在于無須使用額外試劑，檢測周期短，可同時檢測2種以上的腹瀉病原體。然而，鏡檢法需要集卵或特殊染色，靈敏度低，結果客觀性欠佳，要求檢查者具有豐富的專業知識和檢測經驗[8-9]。

1.2免疫學檢測技術 臨床上應用比較廣泛的免疫學檢測技術有金標免疫層析法(金標法)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。二者主要基于抗原抗體的特異性結合及顯色反應原理來檢測腹瀉患兒糞便中輪狀病毒、諾如病毒、艱難梭菌等病原體抗原[10]。其中，金標法具有操作簡便、快速、成本低的優點，只需肉眼判斷顯色帶顏色，無須借助額外儀器[10-11]。然而，金標法受顯色反應信號強度、病原體載量等因素影響，靈敏度低于常規聚合酶鏈反應(PCR)[12]，并且通常是單一病原體檢測，無法對復合感染的患兒進行全面診斷[11]。相對金標法，ELISA更靈敏、特異，而且通量高，如單次檢測標本可達96份；但是隨著金標法的出現，我國ELISA在兒童感染性腹瀉病中應用逐漸減少，主要是因為該檢測方法需要配備酶標儀，且操作步驟較多，檢測時間較長[9,13]。

1.3培養法 培養法在兒童腹瀉病原體檢測中應用廣泛，用于大多數細菌或真菌的鑒定及耐藥性檢測，為抗菌藥物的合理使用提供參考[14-15]。與鏡檢法、免疫學檢測比較，培養法主要優點是通量高、特異度高、檢測成本低[10]。然而，該方法最大的缺點是檢測時間長，獲取檢測結果的時間有數天不等，這導致急性腹瀉患兒病原學診斷的延遲[5]。此外，該方法靈敏度低，結果受抗菌藥物使用、病原體載量、培養基選擇性等因素影響[14,16]，并且操作步驟繁雜，常需要手動操作。

1.4常規PCR PCR通過DNA互補配對進行DNA體外合成，并對相應基因片段進行檢測。目前，逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)在兒童感染性腹瀉的實驗室診斷及研究中應用廣泛，主要用于輪狀病毒、諾如病毒等單一病原體的鑒定和亞型的鑒別[13]。PCR靈敏度高于鏡檢法、免疫學檢測和大便培養，能鑒定低載量病原體[9,16]。然而，該方法只能針對臨床高度懷疑的病原體進行檢測，檢測目標單一，存在假陰性的可能[14]。另外，實驗中的有機溶劑殘留物等對DNA合成有抑制作用，有假陰性的風險[16]。

2 新型分子診斷方法

新型分子診斷方法在病原體核酸或者基因片段水平上明確病原體。常用技術有核酸擴增法、基因芯片法和高通量測序等，但是臨床上應用更廣泛的是基于這些分子診斷技術的眾多商業化檢測板或檢測系統，以提高病原體檢測效率。新型分子診斷方法可以同時檢測多種病原體[1]，并在病原體未知的情況下檢測可能的致病原[17-18]。然而，也有研究提到，由于新型分子診斷技術靈敏度高，甚至可檢測到極低載量病原體，而患兒可能并無相應癥狀，因此檢測結果需結合臨床進行合理解釋[19]。

2.1FilmArray胃腸道感染檢測板(FA-GP) 美國BioFire公司的FA-GP是以多重熒光PCR技術為基礎的自動化檢測板[6]。AXELRAD等[7]將FA-GP和傳統方法(鏡檢法、ELISA法、細菌培養法)檢測結果相比較，結果顯示FA-GP總檢出陽性率(29.2%)明顯高于傳統方法(4.1%)，并且FA-GP的使用可以有效地減少內鏡檢查、放射性檢查和抗菌藥物的使用。與其他新型分子診斷方法比較，FA-GP具有高度自動化、快速、靈敏度高的特點，其檢測性能的評估一直是研究熱點[6-7,18]。

2.2Luminex胃腸道病原檢測板(GPP) 美國Luminex公司的GPP是基于多重PCR技術和微球雜交陣列綜合應用的檢測板[18,20]。一項臨床研究結果顯示，GPP檢測慢性腹瀉患兒的臨床糞便標本的陽性率遠高于傳統方法(鏡檢法、ELISA法、細菌培養法)，而且GPP對腸道病原體檢測的靈敏度和特異度均較高[15]。一項Meta分析顯示，GPP和FA-GP這兩種新型檢測板均可為早期識別腹瀉病原體提供重要的診斷信息，而對于大多數腹瀉病原體而言，GPP靈敏度和后驗概率較FA-GP低[21]。

2.3BD Max檢測系統 常用的BD Max檢測系統為美國BD公司的腸道病原體測試及BD Max腸道細菌擴展檢測板。BD Max腸道病原體測試是以多重PCR技術為基礎的病原檢測方法。BD Max腸道病原體測試包括3個獨立模塊，分別用于檢測常見細菌、病毒和寄生蟲，各模塊可單獨選擇或疊加使用[20]。BD Max腸道擴展檢測板，用于檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌、產腸毒素大腸桿菌、弧菌和志賀單胞菌，作為對常用細菌模塊的補充[22]。大多研究僅評價了BD Max單個模塊的檢測表現。例如，STOKES等[23]報道，BD Max病毒測試與PCR擴增聯合測序比較，二者對糞便標本中的諾如病毒、札如病毒、星狀病毒、輪狀病毒和腺病毒檢測的陽性符合率分別為92.8%、84.9%、93.0%、100.0% 和 95.6%，陰性符合率均≥99.4%，結果表明BD Max病毒測試可有效診斷由以上病毒引起的腸道疾病，適用于腸道病毒高危患者的臨床篩查。BD Max檢測系統的特點是針對不同病原體設有4種檢測模塊，可以根據需要進行選擇，便于攜帶和操作[22-23]。同樣，如果對模塊選擇不當，可能會導致病原體漏檢。

2.4Seegene Allplex胃腸病原檢測系統(Seegene Allplex-GI) 韓國Seegene公司的Seegene Allplex-GI是一種基于qRT-PCR技術的病原體檢測方法[7]。與BD Max檢測系統類似，該檢測系統針對常見細菌、少見細菌、病毒、寄生蟲有4種病原體檢測模塊[20,24]。各模塊可根據患兒的臨床表現單獨選擇或疊加使用，如大便隱血試驗陽性者可選用兩種細菌檢測模塊的組合[7]。MARTN等[25]將Allplex細菌檢測模塊與大便培養聯合質譜鑒定進行比較，結果顯示，在394份臨床糞便標本中，二者的檢出陽性率分別為66.2%和27.7%；將結果不一致的標本經多重PCR驗證時發現，大便培養聯合質譜鑒定漏檢了44份標本，而Allplex漏檢了5份標本；Allplex細菌檢測模塊對引起兒童腹瀉的病原體的靈敏度和特異度均>95%。該系統還可鑒別輪狀病毒、諾如病毒和腺病毒等5種常見病毒的不同基因型，這有助于兒童病毒性腹瀉的流行病學觀察和研究[26]。但由于與BD Max同樣包含多個檢測模塊，Allplex系統也同樣具有可選擇性高的優點和漏檢的風險[20]。

2.5QIAstat-Dx胃腸病原檢測板(GIP) GIP是一種集成了核酸提取、PCR和熒光擴增檢測的多重PCR系統。一項多中心臨床研究采用385份糞便標本評估GIP的檢測性能，并與FA-GP進行比較，將結果不一致的標本采用Allplex系統進行驗證，結果顯示GIP的檢測靈敏度為98.2%，提示GIP檢測范圍廣，靈敏度好[27]。研究顯示，GIP可用于兒童腹瀉病早期診斷，從而降低病原體傳播的風險，進一步降低醫療費用[27-28]。

2.6TaqMan微流控芯片(TAC) 美國Life Technologies公司的TAC是一種qRT-PCR技術和微流控芯片相結合檢測系統[29]。TAC對每份標本可檢測48種目標病原體，并且可以根據需要定制病原體測試模塊[30]。其中，病毒測試可檢測胃腸炎病毒不同基因型，而細菌測試可檢測大腸埃希菌的耐藥基因[31-32]。一項多中心研究對比GPP、多重PCR和TAC對15種腸道病原體的檢測性能，并與細菌培養、ELISA、常規PCR進行了比較[16]。結果顯示，GPP、多重實時PCR和TAC對15種腸道病原體檢測的靈敏度分別為86.2%、94.1%、90.2%，特異度均≥95%；而傳統方法靈敏度因靶標不同波動在20%～85%，特異度為97.3%。結果證明GPP、多重實時PCR和TAC均有很好的檢測性能和臨床表現，靈敏度高于傳統方法。

2.7高通量測序 高通量測序又稱為二代基因測序，是一種同時測序數千到數十億個DNA片段的技術。目前已上市的高通量測序產品種類較多，使用最廣泛的是Illumina系列測序檢測板，如iSeq、MiSeq和MiniSeq等[14]。高通量測序(非靶向測序)覆蓋范圍最為廣泛，不僅可以發現潛在病原體，還能檢測致病菌的耐藥性基因，甚至能檢測到病原體在遺傳基因上發生的突變[32]。因此，不僅能為患兒提供個體化的治療方案，也可為進一步研究提供更多的基因序列數據[33-34]。然而，該測序在兒童感染性腹瀉病原體檢測中不宜作為首選，因為其易受人類、腸道菌群和食物等干擾基因的影響，要求參考更多的基因序列數據[14,33-34]。同時，高通量測序價格較昂貴，需要平臺建設和生物信息學團隊的支持，因此更多用于一些病因不明確、培養較困難的病原體(如艱難梭菌等)檢測或病原體基因研究中[13,27]。

綜上所述，臨床上被廣泛應用的商業化檢測系統的性能比較見表1。

表1 各腹瀉病原體檢測系統的性能比較

3 小 結

相對于傳統檢測方法，新型分子診斷方法在病原體種類覆蓋度、檢測耗時、靈敏性、自動化程度、遠期醫療負擔等方面均具有獨到的優勢。隨著分子生物技術的不斷發展，分子診斷技術成本也將不斷降低，兒童感染性腹瀉病有望實現快速、全面、高靈敏度、高特異度、低成本的檢測，從而早期明確導致腹瀉的病原體，指導臨床合理用藥，預防病原體傳播，降低醫療費用。