糖基化反應條件對豌豆蛋白乳化特性的影響

馬露燕，郭興鳳，朱婷偉，田亞東，段曉杰

（河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

植物蛋白質作為一種來源廣泛的天然食品級大分子，因其具有獨特的界面特性、良好的乳化特性使其在乳液體系構建研究過程中得到了人們的廣泛關注[1]。尤其是豌豆蛋白營養價值高，且不含過敏原，成為近年來一種新興的優質植物蛋白來源[2-3]。但豌豆蛋白在大規模商業生產時功能性質（乳化性、溶解性等）會變差，因而僅作為副產物，造成豌豆蛋白資源的浪費[4]。要解決豌豆蛋白的局限性，進一步提高其營養和加工應用價值，需進一步對豌豆蛋白進行改性。研究表明，蛋白質和糖經過糖基化反應，可提高蛋白質溶解度，且蛋白質-多糖結合物能表現出更好的乳化活性和乳化穩定性[5-7]，其優良的乳化性能歸因于兩者優異的兩親性[8]。且該方法不需要提供特殊裝置，相對簡單、安全、綠色，在功能性蛋白制品生產中有很大的發展空間[9-10]。本課題組前期研究發現，大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）和乳糖在相對濕度79%，溫度60℃條件下發生干法糖基化反應，制備不同接枝度的SPI-乳糖共價復合物，反應24 h后復合物的溶解性和乳化特性明顯提高[11]。因此，有望通過糖基化改性來改善豌豆蛋白的乳化特性。

在糖基化反應過程中，糖基供體的選擇及反應條件都會影響糖基化產物的功能特性。在糖基供體選擇中，低聚木糖一方面可通過糖基化改性修飾蛋白結構來改善蛋白質的功能特性；另一方面也可作為益生元被人體腸道中的細菌發酵利用，選擇性地促進腸道益生菌的生長，進而有益于機體健康[12-13]。此外，糖基化反應中，蛋白質與低聚糖的糖基化速度比多糖快得多，其可作為多糖的良好替代品[14]。基于此，本文利用低聚木糖通過糖基化修飾豌豆蛋白，以乳化特性為評判指標，優化糖基化反應條件。研究蛋白質與糖質量比、反應溫度、反應時間等條件對糖基化復合物乳化特性的影響；并通過響應面法對反應條件進一步進行優化，最終獲得低聚木糖糖基化下乳化特性較好的豌豆蛋白糖基化復合物的制備條件，以期為豌豆蛋白在乳液體系中的應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白（蛋白質含量≥85%）、低聚木糖（≥95%，食品級）：西安金碩果業有限公司；大豆油：益海（周口）糧油工業有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（≥99%，分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；雙蒸水：河南工業大學糧油食品學院8349實驗室自制。

1.2 儀器與設備

可見光分光光度計（722S型）：上海精密科學儀器有限公司；高速剪切均質機（GL-20C型）：上海弗魯克流體機械制造有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-6型）、磁力攪拌器（JJ-6A型）：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆蛋白-低聚木糖糖基化復合物的制備

參考文獻[15]采用濕法糖基化方法，將豌豆蛋白與低聚木糖按一定的質量比溶解于蒸餾水中，并保持蛋白濃度為1%，磁力攪拌2 h混勻，調節pH值為7，于4℃冰箱中放置過夜，使其充分水合。將樣品放置在75℃水浴鍋中反應90 min，取出在冰水中冷卻5 min，以終止反應，得到糖基化產物。

1.3.2 乳化特性的測定

參考文獻[16]測定糖基化產物的乳化特性：取15mL糖基化樣品溶液，加入5 mL大豆油混合后進行剪切[室溫（25 ℃）、12 000 r/min、2 min]處理。剪切處理后分別在0、10 min從底部取樣50 μL，加入5 mL 0.1%SDS，測定500 nm處的吸光值，以SDS溶液為空白。乳化活性計算公式如下。

式中：A500為500 nm處的吸光值；N是稀釋倍數；Φ是體系中油相所占體積分數；C是蛋白質的濃度，g/mL；L是比色皿光徑，1 cm。

乳化穩定性計算公式如下。

式中：A0為0min的吸光值；A10為10min的吸光值。

1.3.3 豌豆蛋白與低聚木糖質量比對豌豆蛋白乳化特性的影響

調節溶液pH值分別為7.0，反應溫度為70℃，控制糖基化反應時間為90 min，調控豌豆蛋白與低聚木糖質量比分別為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，測定不同豌豆蛋白與低聚木糖質量比下糖基化產物的乳化特性。

1.3.4 反應溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響。

調節溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與低聚木糖質量比為2∶1，糖基化反應時間為90 min，調控反應溫度分別為70、80、90、100℃，測定不同反應溫度下糖基化產物的乳化特性。

1.3.5 反應時間對豌豆蛋白乳化特性的影響

調節溶液pH值分別為7.0，控制豌豆蛋白與低聚木糖質量比為2∶1，反應溫度為80℃，調控糖基化反應時間分別為30、60、90、120 min，測定不同反應時間下糖基化產物的乳化特性。

1.3.6 Box-Behnken響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇反應溫度、反應時間、豌豆蛋白與低聚木糖質量比3個因素為自變量，以產物的乳化特性為響應值設計試驗，研究各自變量及其交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，進一步優化低聚木糖糖基化豌豆蛋白改性工藝的最佳參數。

設計類型為三因素三水平共17個試驗點，其中5個為中心試驗，12個為析因試驗，利用Design Expert 8.0.6對試驗結果進行回歸擬合及方差分析，試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 數據處理

采用SPSS 20、Excel軟件對試驗數據進行處理、作圖及顯著性分析，顯著性水平設為0.05。采用Design Expert 8.0.6軟件對響應面數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 反應條件對豌豆蛋白乳化特性的影響

2.1.1 豌豆蛋白與低聚木糖質量比對豌豆蛋白乳化特性的影響

在豌豆蛋白濃度為1%，反應溫度為70℃，反應時間為90 min時，豌豆蛋白與低聚木糖質量比對糖基化反應過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖1所示。

圖1 豌豆蛋白與低聚木糖質量比對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.1 Effect of mass ratio of pea protein to xylooligosaccharide on emulsifying properties of modified pea protein

由圖1可知，隨著豌豆蛋白與低聚木糖質量比的增加，豌豆蛋白糖基化產物的乳化活性和乳化穩定性均呈現先上升后下降的趨勢。在一定的豌豆蛋白與低聚木糖質量比下，溶液黏性可使糖分子與蛋白質分子接觸機會增大，糖基化反應順利進行；低聚木糖附著在蛋白質表面增加了空間位阻，因此油滴不易聚集和凝結，從而表現出糖基化產物乳化活性和乳化穩定性提高[17]。當糖分子過多，溶液黏性隨之增加，反而不利于糖基化反應進行，導致乳化特性較差[18]。可見適當的蛋白質與糖的質量比有利于獲得乳化特性較好的糖基化產物。因此，確定豌豆蛋白與低聚木糖的質量比為2∶1，此時糖基化產物具有高的乳化特性，乳化活性和乳化穩定性分別為10.34 m2/g和61.75%。

2.1.2 反應溫度對豌豆蛋白乳化特性的影響

在豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與低聚木糖質量比為2∶1，反應時間為90 min時，反應溫度對糖基化反應過程中豌豆蛋白乳化特性的影響見圖2。

圖2 反應溫度對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on emulsifying properties of modified pea protein

由圖2可知，整體上，隨著反應溫度的升高，糖基化產物的乳化活性和乳化穩定性呈現先升高后下降的趨勢。當反應溫度在80℃時，糖基化產物具有較好的乳化特性(乳化活性12.3 m2/g，乳化穩定性70.15%)，不同反應溫度的乳化穩定性無顯著性差異，故以乳化活性最高為最佳反應溫度。反應溫度是影響糖基化反應進程的一個重要指標，適當的反應溫度，使蛋白質變性伸展，多肽鏈被解聚成小分子肽和游離氨基酸，加快了糖與蛋白質的結合，使乳化活性升高；反應溫度過高時，蛋白質分子發生聚集，不利于糖和蛋白質的結合[19]。

2.1.3 反應時間對豌豆蛋白乳化特性的影響

當豌豆蛋白濃度為1%，豌豆蛋白與低聚木糖質量比為2∶1，反應溫度為70℃時，反應時間對糖基化反應過程中豌豆蛋白乳化特性的影響如圖3所示。

圖3 反應時間對改性豌豆蛋白乳化特性的影響Fig.3 Effect of reaction time on emulsifying properties of modified pea protein

由圖3可知，在0～120 min的反應時間段，隨著反應時間的延長，乳化活性和乳化穩定性均呈現先增加后降低的趨勢。這是由于隨著反應時間的延長，糖和蛋白質不斷結合，乳化活性隨之提高，而反應時間過長，更多的親水性糖分子附著在豌豆蛋白上，這會相應地降低乳化活性[20]。當反應時間為60 min時，糖基化產物具有較好的乳化活性，乳化穩定性無顯著變化，此時乳化活性為11.83 m2/g；乳化穩定性為56.20%。

2.2 最佳反應條件的確定

在反應溫度（A）、反應時間（B）、豌豆蛋白與低聚木糖質量比（C）單因素研究的基礎上，以乳化特性（乳化活性和乳化穩定性）為響應指標，采用Box-Benhnken響應面優化設計方案，具體設計方案及試驗結果見表2。同時對結果進行多元回歸分析，結果如表3和表4所示。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

表3 乳化活性回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of emulsifying activity regression model

表4 乳化穩定性回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of emulsifying stability regression model

以反應溫度（A）、反應時間（B）、豌豆蛋白與低聚木糖質量比（C）為自變量，通過對優化結果進行多元回歸分析得到乳化活性（Y1）、乳化穩定性（Y2）和反應條件之間的二次多項式回歸方程分別為Y1=-23.567 04+0.692 45A+0.107 12B+4.843 50C-0.000 305AB-0.006AC-0.017 7BC-0.004 315A2-0.000 306 4B2-0.651C2，R2=0.962 1；Y2=-65.164 68+2.2648 0A+0.721 66B+0.721 66C-0.004 562 5AB+0.145 87AC-0.111 15BC-0.014 364A2-0.000 786 3B2-2.935 75C2，R2=0.967 7。其中，由模型擬合F檢驗值可知，乳化活性F=19.72，P 值=0.000 4<0.01，乳化穩定性 F=23.29，P值=0.000 2<0.01，說明該模型擬合性較好，達到顯著水平；同時，失擬項：乳化活性F=3.31，P值=0.139 1>0.05，乳化穩定性 F=1.67，P 值=0.309 5>0.05，模型失擬性檢驗不顯著。去掉對乳化活性影響不顯著的交互因素 AB、AC 后模型 R2=0.948 5、調整 R2=0.908 5、預測R2=0.772 8、變異系數=4.02。對于乳化穩定性模型R2=0.967 7、調整 R2=0.926 1、預測 R2=0.690 1、變異系數=2.93。結果表明該模型擬合度好，可以很好地對響應值（乳化特性）進行預測。

由表3和表4得到的回歸方程系數顯著性檢驗可得，選取的反應溫度、反應時間及豌豆蛋白與低聚木糖質量比3個因素對豌豆蛋白糖基化復合物的乳化特性有重要影響。對一次項回歸系數的絕對值大小排序，可得乳化活性中3個因素的影響順序為C>A>B，乳化穩定性3個因素的影響順序為C>B>A。此外，交互作用中，一次項A、B、C，交互項BC，二次交互項A2、B2對改性豌豆蛋白乳化活性影響極顯著，二次項C2影響顯著。一次項B、C，交互項AB、AC、BC，二次交互項A2、C2對改性豌豆蛋白乳化穩定性影響極顯著，二次項B2影響顯著。這說明各因素對糖基化產物的乳化活性和乳化穩定性的影響不是簡單的線性關系。

為進一步研究各因素之間交互作用對豌豆蛋白乳化特性的影響，用Design-Expert 8.0.6進行各因素之間的交互作用響應面分析，結果如圖4和圖5所示。

圖4 各因素交互作用對乳化活性影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying activity

圖5 各因素交互作用對乳化穩定性影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying stability

圖4直觀反映出蛋白-糖質量比和反應時間對豌豆蛋白乳化活性的影響，當豌豆蛋白與低聚木糖質量比固定時，乳化活性隨著反應時間的增加呈先升高后降低的趨勢；圖5直觀反映出各影響因素交互作用對乳化穩定性的影響，當豌豆蛋白與低聚木糖質量比不變時，乳化穩定性隨著反應溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。

2.3 最佳工藝條件驗證

試驗表明，豌豆蛋白與低聚木糖質量比、反應溫度、反應時間均可影響糖基化反應進程，進而影響糖基化產物乳化特性的變化。采用Design-Expert 8.0.6進行模型預測，預測工藝條件為反應溫度74.63℃、反應時間93.65 min、豌豆蛋白與低聚木糖質量比1.86∶1，預測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.13 m2/g、乳化穩定性為60.44%。根據實際試驗條件，在反應溫度75℃、反應時間90 min、豌豆蛋白與低聚木糖質量比2∶1條件下測得乳化活性為12.32 m2/g、乳化穩定性為59.64%，調整后預測改性豌豆蛋白的乳化活性為12.19 m2/g、乳化穩定性為60.16%。實際值與預測理論值接近，說明此模型優化結果可靠。

3 結論

本試驗以豌豆蛋白與低聚木糖為原料，采用濕法糖基化方法制備豌豆蛋白-低聚木糖復合物。通過單因素試驗和響應面法建立糖基化復合物制備條件（豌豆蛋白與低聚木糖質量比、反應溫度、反應時間）的數學模型，根據回歸方程分析及預測模型，得到最佳制備工藝條件。整體上，模型擬合度好，可以很好地對反應過程中豌豆蛋白乳化特性進行預測。這3個因素對豌豆蛋白乳化活性影響大小為豌豆蛋白與低聚木糖質量比>反應溫度>反應時間；對乳化穩定性影響大小為蛋白-糖比例>反應時間>反應溫度。最佳工藝條件為反應溫度75℃、反應時間90 min、豌豆蛋白與低聚木糖質量比2∶1，測得乳化活性為12.32 m2/g、乳化穩定性為59.64%。該研究將為豌豆蛋白在乳液體系中的應用奠定基礎。