茉莉酸甲酯對脆紅李采后病原菌的抑制作用

瞿光凡，巴良杰，雷霽卿，馬超，張旭陽，曹森

（貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005）

脆紅李（Prunus salicina cv.‘Cuihongli’）屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus L.）果實[1]，廣泛種植于川、渝、黔等西南高山地區[2]。脆紅李果實成熟采收于高溫多雨季節，果實極易受到損傷、果肉變軟以及遭受病原菌的侵染，導致果實腐敗變質，脆紅李貯藏期腐爛是脆紅李產業急需解決的問題。目前，國內外已報道的李果病害主要有褐腐病、炭疽病、黑霉病、黑斑病、紅點病、袋果病等[3-6]。凡先芳等[3]采用1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）結合戊唑醇處理青脆李，顯著降低青脆李果實在貯藏期間褐腐病的發生。趙寧等[4]對桃形李采后橘青霉進行分離鑒定，發現致病菌為擴展青霉Penicillium expansum，但關于脆紅李采后貯藏期致病菌的種類及病害防治的研究較少。

目前，控制采后水果腐敗變質的常見技術有化學殺菌劑處理、減壓氣調以及低溫貯藏，而化學殺菌劑的藥量殘留不易控制，減壓氣調及低溫貯藏不能完全抑制病原菌的生長繁殖[3，7-9]。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是一種植物內源性激素，不僅參與調節采后果蔬的生長、分化、成熟等生理活動，還能誘導增強采后果蔬在貯藏過程中抗冷性及抗病性[10-13]。已有研究表明茉莉酸甲酯能顯著提高獼猴桃[14]、藍莓[15]、番茄[16]等采后農作物的抗病性及保鮮效果。Wang等[15]報道了茉莉酸甲酯通過激活苯丙素途徑以及提高果實內防御相關酶來誘導提高藍莓對灰霉病的抗病性。黎曉茜等[17]研究結果表明茉莉酸甲酯通過破壞獼猴桃軟腐病菌的細胞膜通透性、促使細胞壁溶解以及細胞內物質外滲，從而有效地抑制病原菌的生長繁殖。本研究從貯藏期脆紅李病果中分離鑒定出兩株病原菌，探究不同濃度茉莉酸甲酯對病原菌的體外抑制作用，并進行室內毒力測試，以期為脆紅李采后病害防控提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脆紅李：2020年8月采摘于貴陽市修文縣谷堡鄉實驗基地，為八九成熟果實，果實采后常溫放置至果面長菌后進行分離鑒定；茉莉酸甲酯（純度98%，分子量224.30）：上海麥克林生化科技有限公司；引物ITS1和 ITS4、DNA Marker C、DNA提取試劑盒、雙蒸水（ddH2O）：生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextroseagar，PDA）：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ChemiDoc免染型蛋白印跡成像系統：成都百樂科技有限公司；CX21光學顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；SHP-2500低溫生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離與純化

1.3.2 病原菌形態學鑒定

將純化的病原菌接種于新的培養基上，于28℃恒溫培養并觀察記錄各致病菌在PDA培養基上的菌落顏色、特征以及基部變化，并結合各致病菌在光學顯微鏡下菌絲、分生孢子及孢子梗的形態與結構來初步鑒定病原菌。

1.3.3 病原菌致病性檢測

病原菌致病性測定依據科柯赫法則進行。挑選健康、無病蟲害、無損傷的脆紅李果實，用無菌水沖洗果實表皮，75%酒精擦拭消毒后再用無菌水沖洗2次～3次，置于超凈工作臺中自然晾干。采用直徑為4 mm的無菌打孔器取菌餅損傷接種于脆紅李果實，每種致病菌重復3個果，并將損傷接種的果實置于溫度25℃、濕度95%的培養箱中培養5 d，記錄果實的發病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑。挑取病斑處的菌絲進行劃線分離，獲得純病原菌后與原接種的菌株進行形態鑒定對比，其形態一致后進行下一步試驗。

1.3.4 病原菌分子生物學鑒定

用無菌鑷子挑取一定量的病原菌菌絲體于無菌研缽中，液氮研磨至粉末狀，參照植物基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA。25 μL反應體系：Taq Master Mix 12.5 μL、引物 ITS1 和 ITS4 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 補加至 25 μL。選取真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行病原菌rDNA-ITS序列擴增，其擴增程序設置：94℃預變性3 min；94℃變性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30個循環；72℃終延伸10 min。對聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物進行測序，測序結果在NCBI網站進行BLAST比對分析，下載同源性較高的菌株序列，采用MEGA 7軟件以鄰接法構建系統發育樹[7]，并結合病原菌的形態特征對其進行鑒定。

1.3.5 茉莉酸甲酯對病原菌體外抑制及室內毒力測試

此前一直被詬病的金融業脫實向虛問題，一方面反映了金融業偏重于體系內空轉、陶醉于“錢生錢”的金融游戲、忽略了對社會客觀金融需求的照顧；另一方面也表明實體經濟面臨困境，這顯然也不利于金融業的可持續發展。

根據菌絲生長速率法測定茉莉酸甲酯對病原菌體外抑制效果，分別稱取不同質量的茉莉酸甲酯加入到滅菌的PDA培養基中，充分搖勻。使每個平板PDA培養基中茉莉酸甲酯濃度分別為 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L，待培養基冷卻后備用。用無菌打孔器（直徑4 mm）從培養5 d的病原菌菌落上打取菌餅，菌絲面放于培養基中央，每個濃度重復3次。于28℃恒溫培養箱中培養5d，每日采用十字交叉法測量菌落直徑。以茉莉酸甲酯濃度的對數值為橫坐標，抑菌率為縱坐標，計算茉莉酸甲酯對病原菌菌絲毒力方程，并采用Graphpad prism 7軟件計算半最大效應濃度（half maximal effective concentration，EC50），抑菌率的計算公式如下。

1.4 數據分析

試驗基礎數據采用Excel 2016軟件進行統計分析，采用SPSS19.0軟件的Duncan法對數據進行差異顯著性分析（P<0.05表示差異顯著），采用Origin 2018對數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學鑒定

經組織分離、劃線分離及單孢培養，根據形態特征與培養特性獲得兩種菌株，記作CHL-1和CHL-2，脆紅李病原菌形態特征見圖1。

圖1 脆紅李病原菌形態特征Fig.1 Morphological characteristics of pathogens of Prunus salicina

第一種（圖1a）菌絲初期為白色絨毛狀，后期逐漸變成灰色且菌絲端有微小的顆粒，基部初期由暗黃色逐步轉化為灰色或暗灰色（圖1b），培養7 d后產生分生孢子，光學顯微鏡下菌絲呈淡黃色，分生孢子呈橢圓形或卵泡形、透明無隔膜（圖1c）。其形態特征及培養特性與He等[19]研究的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）一致，初步鑒定為灰葡萄孢屬（Botrytis sp）。

第二種（圖1d）菌絲初期緊密、呈米黃色，后期逐漸變為灰綠色；基部外層暗紅色，內層黑色或褐色且有褶皺裂痕（圖1e），培養5 d后產生不成熟的分生孢子，顯微鏡下菌絲透明且有分隔，孢子呈卵圓形或棒狀，有明顯的縱橫分隔（圖1f）。其形態特征與王丹等[7]研究的鏈格孢菌（Alternaria alternata）的形態一致，初步鑒定為鏈格孢屬（Alternaria sp）。

2.2 病原菌致病性檢測

從脆紅李果實發病組織中分離純化出2株病原菌，采用刺傷接種法將2株病原真菌回接至健康的果實上，置于25℃、95%濕度的培養箱中培養5 d，觀察發病情況，結果見圖2、圖3。

圖2 病原菌回接脆紅李果實5 d發病癥狀Fig.2 Disease symptom of Prunus salicina after inoculation with pathogens for 5 days

圖3 病原菌回接脆紅李果實5 d時病斑直徑Fig.3 Diameter of diseased spot of Prunus salicina after inoculation with pathogens for 5 days

菌株CHL-1刺傷接種5 d后，刺傷部位周圍長出大量肉眼可見白色絨毛狀菌絲（圖2c），果肉組織松弛變軟、褐變逐漸擴展至果心（圖2d）；菌株CHL-2刺傷接種5 d后，損傷部位長出灰綠色菌絲（圖2e），果肉組織較為緊密，刺傷部位周圍果肉褐變較淺（圖2f），而對照組均無發病癥狀（圖2a），果肉組織緊密、無褐變病癥（圖2b）。取回接果實發病部位再次進行分離培養，得到的菌株形態特征及培養特性與原菌株（CHL-1、CHL-2）一致。

由圖3可知，兩種病原菌刺傷接種5 d后，菌株CHL-1與CHL-2的病斑直徑分別為18.43、10.60 mm，并且菌株CHL-1的病斑直徑顯著大于菌株CHL-2（P<0.05），結合圖1可知，菌株CHL-1對果實的致病性強于菌株CHL-2。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

提取兩種病原菌DNA進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳成像，結果見圖4。系統發育樹結果見圖5。

圖4 兩株病原菌rDNA-ITS序列瓊脂糖凝膠電泳成像圖Fig.4 rDNA-ITS agarose gel electrophoresis of two strains of pathogens

圖5 基于rDNA-ITS序列病原菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of pathogens based on rDNA-ITS sequence

由圖4可知，菌株CHL-1與CHL-2的rDNA-ITS序列長度為500 bp～700 bp。由圖5可知，菌株CHL-1的rDNA-ITS序列與Botrytis cinerea NR151843處于同一分支且相似度高達100%，結合其形態學鑒定，確定菌株CHL-1為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。菌株CHL-2的rDNA-ITS序列與Alternaria alternata NR163686具有較高的同源性且處于同一分支，結合形態學鑒定，確定菌株CHL-2為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。

2.4 茉莉酸甲酯對脆紅李采后病原菌的抑制作用

2.4.1 茉莉酸甲酯對病原菌體外抑制效果

茉莉酸鉀酯對脆紅李病原菌體外抑制效果見圖6。

由圖6可知，在含不同濃度茉莉酸甲酯的培養基中，灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的菌落直徑均隨著培養時間的延長呈上升的趨勢。在培養2 d時，不同濃度的茉莉酸甲酯處理均顯著抑制灰葡萄孢菌和鏈格孢菌菌絲生長（P<0.05），其中0.4、0.5 mmol/L茉莉酸甲酯完全抑制兩株菌的生長。在培養5d時，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L處理組對灰葡萄孢菌抑制率分別為31.4%、47.0%、88.4%、89.3%、96.9%，其中 0.3、0.4、0.5 mmol/L處理組與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）；而對鏈格孢菌抑制率為8.1%、37.1%、56.0%、86.3%、94.6%，其中0.4、0.5 mmol/L處理組與其他處理組均有顯著性差異（P＜0.05）。綜上可知，適宜濃度的茉莉酸甲酯能有效抑制脆紅李采后病原菌的生長。

圖6 茉莉酸鉀酯對脆紅李病原菌體外抑制效果Fig.6 In vitro inhibitory effect of methyl jasmonate on the pathogens of Prunus salicina

2.4.2 茉莉酸甲酯對病原菌的室內毒力測試

基于茉莉酸甲酯體外抑制效果試驗，分別對灰葡萄孢菌、鏈格孢菌在2 d和5 d時菌絲的生長情況及數據進行統計分析，分別求出毒力方程和EC50。

由表1可知，在2 d時，茉莉酸甲酯對灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的EC50分別為0.154、0.193 mmol/L，而培養5 d時，EC50分別為0.228、0.348 mmol/L。由此可見，茉莉酸甲酯對灰葡萄孢菌的抑菌效果優于鏈格孢菌。

表1 茉莉酸甲酯對灰葡萄孢菌、鏈格孢菌的室內毒力Table 1 Indoor toxicity of methyl jasmonate to Botrytis cinerea and Alternaria alternata

3 討論

灰葡萄孢菌的有性態為富克爾葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana），其屬包括23種，常見具有致病性的有中華葡萄生葡萄孢（Botryotinia sinoviticola）、草莓葡萄孢（Botryotinia frgariae）和卡羅萊納葡萄孢（Botryotinia caroliniana）[20-21]。鏈格孢屬真菌主要依據分生孢子的形狀、大小、縱橫分隔狀況以及分生孢子梗形態特征進行種級形態分類，常見的鏈格孢菌有草莓鏈格孢、日本梨鏈格孢、蘋果鏈格孢和煙草鏈格孢等[22]。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）在采后農作物上的致病能力強[23]，可以侵染導致葡萄[24]、番茄[16]、西蘭花[25]、桔柚[26]等多類經濟農作物快速腐敗。本研究發現，引起脆紅李采后腐敗的主要病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）。

病原菌浸染是導致果蔬采后品質劣變的主要因素之一。大量研究表明，化學藥物可有效殺死病原菌。但化學藥物廣泛應用導致病原菌耐藥性且嚴重影響食品安全。因而也有很多學者不斷開發天然、高效、安全的貯藏技術，從而有效延長果實的貯藏期，提高果實采后品質。茉莉酸甲酯屬于一種植物激素，據報道，其已廣泛應用于果蔬采后保鮮，有效維持果蔬采后品質、延緩果蔬營養物質的損失，并能提高果實采后抗病性[27]。研究發現，茉莉酸甲酯能有效抑制葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）菌絲生長，破壞菌絲細胞膜完整性導致病原菌失活[17]。此外，于萌萌等[28]研究表明，茉莉酸甲酯不僅有效抑制番茄灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的生長，還促進果實抗病相關蛋白、酚類物質及番茄紅素的積累，增強番茄果實的抗病性。本研究體外試驗結果表明，茉莉酸甲酯有效抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）的菌絲生長，室內毒力測試發現茉莉酸甲酯在第2天、第5天時，對灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的EC50分別為0.154、0.193 mmol/L 和 0.228、0.348 mmol/L，此結果表明茉莉酸甲酯對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的抑菌效應強于鏈格孢菌（Alternaria alternata）。但關于茉莉酸甲酯的抑菌機制及其對脆紅李的貯藏保鮮效果還需進一步深入研究。

4 結論

本研究發現引起脆紅李腐敗的病原菌主要為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和鏈格孢菌（Alternaria alternata），并通過體外試驗發現茉莉酸甲酯在一定程度上能有效抑制兩株病原菌的生長。因此，茉莉酸甲酯處理可作為脆紅李采后病害防控的一種有效策略。