超聲輔助吐溫80提取發芽小米GABA和多酚的工藝優化

高曉麗，鮑玉琪

（呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033001）

小米，也稱之為粟或稷，是禾本科草本植物粟米經加工脫殼后的成品。小米中除富含維生素B1、B12、不飽和脂肪酸外，還含有纖維素、植物甾醇、多酚活性物質、γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）等多種功能性成分[1]。多酚是具有多個酚基團的一類化學元素的總稱[2]，小米中所含有的酚類物質包括單寧、植酸、酚酸及其衍生物等，所有這些酚類物質都具有降血糖、抗致突變、抗炎、抗衰老、防輻射等獨特的生理功效[3]。GABA是一種游離氨基酸，主要存在于胚芽中，在植物生長發育中發揮保護功能[4]，還可促進酚類物質合成從而增強植物抗逆性[5-7]。其化學性質穩定，具有抗壓健腦、增強長期記憶[8]、降血壓、抗焦慮[9]、解毒等多種功效[10]。植物中一般GABA含量較低[11]，但在受到刺激時含量會大量提升，如楊樹葉在受鹽脅迫后GABA含量增加了2倍[12]，機械損傷可使鮮切梨GABA累積[13]，而粟米發芽過程中因相關內源酶激活而使發芽小米中酚類、黃酮類化合物及GABA的含量提升[14-15]。

基于發芽谷物較高的營養價值，目前國內有較多的相關研究。徐麗[16]的研究發現經發芽處理的小米GABA含量提高了2.9倍，其得率為251.46 mg/100 g；李彩云[17]的研究表明粟谷樣品中黃酮、總氨基酸含量和必需氨基酸含量會隨發芽時間的延長而增加；沙坤等[18]的研究發現粟米在發芽過程中總酚含量逐漸增加，在72 h后趨于平緩，總酚含量達到約1.7 mg/g。以上研究都表明發芽可以有效提升小米中GABA和多酚的含量。

超聲波輔助表面活性劑提取法與傳統提取法相比，因具有提取時間短、效率高的優點而被廣泛研究與應用。陳瓊等[19]的研究表明此法能優化青錢柳中總黃酮的提取；肖道安[20]在吐溫80協同酶法提取桑葉總黃酮的研究中發現吐溫80有顯著的增溶作用。本文旨在通過超聲輔助-表面活性劑法富集發芽小米中GABA和多酚物質的含量，提高發芽小米GABA和多酚的得率，為其工業化生產提供理論依據，以期降低成產成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷米：山西天公種業有限公司；谷芽：安國市廣盛商貿有限公司；吐溫80（化學純）：天津市凱通化學試劑有限公司；γ-氨基丁酸標準品（色譜純98%）：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標準品（色譜純98%）、福林酚試劑：國藥集團化學試劑有限公司；次氯酸鈉、重蒸酚、硼酸（化學純）：天津市化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿有限公司；超聲波清洗機（SB-3200DTDN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；生化培養箱（SPX-250）：上海躍進醫療器械有限公司；高速萬能粉碎機（FW-400A）：北京科偉永興儀器有限公司；可見分光光度計（VIS-723N）：北京瑞利分析儀器有限公司；臺式高速離心機（Neofuge13）：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發芽小米制備與前處理

谷米經除雜和清洗后與3.5 mmoL/L的CaCl2溶液以 1∶10（mg/mL）的比例混合，35℃下浸泡 12 h后平鋪放入墊有濾紙的培養皿內，再覆蓋上六層紗布，控制發芽濕度95%，在30℃下發芽72 h，之后45℃下烘干制得成品發芽小米。

參考寧亞維等[21]的方法脫除發芽小米中的黃色素：準確稱取干燥后的發芽小米粉1.0 g置于錐形瓶中，首先加入5 mL無水乙醇提取發芽小米中的黃色素，于60℃水浴保溫2 h，然后于8 000 r/min、離心20 min以后，上清液即為黃色素提取液，將其棄去留取沉淀物。1.3.2 GABA的提取和優化試驗

1.3.2.1 GABA的提取與測定

取上述沉淀物，按一定料液比加入吐溫80溶液，設置提取溫度、超聲功率，經超聲提取后，測定GABA得率。空白對照：脫去黃色素的沉淀物加10倍蒸餾水于40℃下浸提1 h，每隔10 min搖動一次，得粗提液。粗提液于10 000 r/min條件下離心15 min后得到待測提取液，測定GABA得率。參照趙大偉等[22]的方法繪制標準曲線并測定GABA含量。

1.3.2.2 單因素試驗

取脫除黃色素的發芽小米沉淀物5份，設置不同吐溫80質量分數（0%、2%、4%、6%、8%）、超聲溫度（20、25、30、35、40 ℃）、超聲時間（5、15、25、35、45 min）、料液比[1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22（g/mL）]、超聲功率（90、108、126、144、162 W），研究各單因素對 GABA 得率的影響。以吐溫80質量分數4%、料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度25℃、超聲時間15 min、超聲功率126 W為基準進行試驗。

1.3.2.3 正交試驗

以GABA得率為指標，以吐溫80質量分數、超聲溫度、超聲時間、料液比和超聲功率5個因素作為影響發芽小米多酚得率的主要因素，并設計L16（45）正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 GABA提取正交試驗因素水平Table 1 Factor level of GABA extraction orthogonal test

1.3.3 多酚的提取和優化試驗

1.3.3.1 多酚提取與測定

取脫去黃色素的發芽小米沉淀物，加入5倍質量、體積分數為60%的乙醇和一定量的吐溫80溶液，設定超聲功率162 W，在不同溫度下提取多酚，測其得率。

空白對照：取脫去黃色素后的沉淀物，加入5倍70%的乙醇，真空抽濾后在5 000 r/min的條件下離心10 min，定容得到待測提取液。多酚含量測定參照朱仙慕等[23]和王若蘭等[24]的Folin-Ciocaltue法測定。

1.3.3.2 單因素試驗

取經脫去黃色素的發芽小米沉淀物5份，設置不同吐溫80質量分數（5%、10%、15%、20%、25%）、超聲溫度（25、35、45、55、65 ℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]作為4個單因素，考察各因素對多酚得率的影響。以吐溫80質量分數 10%、料液比 1∶10（g/mL），超聲溫度 45℃、超聲時間10 min為基準試驗條件。

1.3.3.3 響應面試驗

以吐溫80質量分數、超聲溫度、超聲時間、料液比4個因素為自變量，選取得率較高的3個水平，以多酚得率為響應值，分析各因素對響應值的影響。響應面試驗設計見表2。

表2 響應面試驗設計Table 2 Response surface experimental design

1.4 數據處理

用origin 2018進行數據處理及圖表繪制；采用正交設計軟件進行正交設計及方差分析確定發芽小米GABA最佳提取工藝；采用Design-Expert 10.0軟件設計響應面試驗，并進行方差分析優化多酚提取工藝。

2 結果與分析

2.1 GABA的提取

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 吐溫80質量分數對GABA得率的影響

吐溫80質量分數對GABA得率的影響見圖1。

圖1 吐溫80質量分數對GABA得率的影響Fig.1 Effect of Tween 80 mass fraction on GABA yield

經試驗得到空白對照組GABA的得率為1.213mg/g。由圖1可知，與空白組相比，加入吐溫80后GABA的得率大幅度增加，原因可能是由于GABA自身極易溶于水，且吐溫80作為增溶劑可以降低溶液表面張力，更利于被超聲波破碎的細胞中易溶性物質的浸出；吐溫80質量分數大于2%時，隨著吐溫80質量分數的增加，GABA的得率不斷減小，其原因可能是吐溫80質量分數達到了臨界膠束濃度，且其對其它雜質的增溶作用也會影響吸光度的大小[25]。由此可以確定最佳吐溫80質量分數為2%。

2.1.1.2 超聲溫度對GABA得率的影響

超聲溫度對GABA得率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對GABA得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on GABA yield

由圖2可知，GABA得率隨超聲溫度的升高先增大后減少，當超聲溫度為30℃時得率最高。此變化的原因可能是溫度較低，分子的熱運動緩慢，在較短的時間不能完全浸出；當溫度上升至超過30℃時，其得率下降，原因可能是由于，溫度過高，破壞了GABA結構，使得GABA從提取液中析出，其得率反而下降[26]，可初步確定因素最佳水平為30℃。

2.1.1.3 超聲時間對GABA得率的影響

超聲時間對GABA得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對GABA得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on GABA yield

由圖3可知，在控制其它條件不變的情況下，隨超聲時間的延長，GABA得率在5 min～25 min內不斷增加，當超聲時間達到25 min時，發芽小米GABA的得率達到最大值（2.219 mg/g）；而繼續延長超聲波提取時間，GABA得率的增加效果并不明顯，且逐漸趨于平穩。可能是因為在此條件下，提取液中溶質濃度已經達到固液平衡，延長超聲時間提取效果優化并不明顯。確定GABA適宜的超聲提取時間為25 min。

2.1.1.4 料液比對GABA得率的影響

料液比對GABA得率的影響見圖4。

圖4 料液比對GABA得率的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on GABA yield

由圖 4 可知，料液比為 1∶14（g/mL）～1∶20（g/mL）時，隨著提取溶劑用量的增加，發芽小米粉與料液的接觸面積增大，使得GABA的得率增加；在1∶20（g/mL）之后，繼續增加濃度差不僅使得單位提取液中GABA的濃度降低，而且增大提取溶劑用量的同時會增加生產成本，因此從生產成本和GABA提取效果兩個角度考慮，確定最佳的提取料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.1.5 超聲功率對GABA得率的影響

超聲功率對GABA得率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對GABA得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on GABA yield

由圖5可知，GABA得率隨著超聲功率的增加先增大，當超聲功率為126 W時得率達到最大值，這可能是由于在90 W～108 W內，隨超聲功率增加其振動頻率也增大，分子熱運動加劇，使得GABA更容易溶出[27]，故其得率不斷增加；超聲功率在108 W～126 W時，GABA的增長幅度較小，可能是因為超聲波對發芽小米細胞的破壞作用使得GABA的溶出較完全，繼續增大功率其得率不會顯著增大；當超聲功率大于126 W時，GABA得率降低，但降低趨勢較為平緩。其原因可能是盡管GABA分子結構穩定，但超聲波功率過高也會對GABA分子結構有一定的破壞作用，影響其得率。因此從節約能源和提取效果兩方面考慮，確定最適超聲功率為126 W。

2.1.2 正交優化試驗

正交試驗設計及結果如表3所示。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，正交試驗最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2，即吐溫80質量分數6%，超聲溫度為35℃，超聲時間 25 min，料液比 1∶18（g/mL），超聲功率為126 W。比較4個因素的極差大小可知對評價指標影響的大小關系依次為A、E、D、B、C，其中吐溫80質量分數對得率的影響最大，其次是超聲功率、料液比、超聲溫度，超聲時間的影響最小。

對數據進行方差分析，結果見表4和表5。

表4 方差分析（a=0.05）Table 4 Analysis of variance

表5 方差分析（a=0.01）Table 5 Analysis of variance

方差分析結果表明在a=0.05時，5個因素對GABA得率無顯著性影響；在a=0.01時，A對GABA得率有顯著性影響。綜上所述，最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2，即吐溫80質量分數6%，超聲溫度為35℃，超聲時間25 min，料液比 1∶18（g/mL），超聲功率為 126 W。

2.1.3 驗證試驗

根據正交試驗結果，最佳條件下得到發芽小米GABA的最終得率為4.70 mg/g，優于其它試驗組。

2.2 多酚提取

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 吐溫80質量分數對多酚得率的影響

吐溫80質量分數對多酚得率的影響見圖6。

經試驗得到空白對照組多酚得率為0.651 mg/g。由圖6可知，在吐溫80質量分數為5%～10%時，多酚得率隨其濃度的增加而增大，這可能是由于吐溫80的增溶作用加速了多酚物質的浸出；但當吐溫80質量分數大于10%時，得率開始不斷降低，原因可能是其濃度過高大于臨界膠束濃度，溶入膠束中的多酚活性物質的再溶出受到阻礙[28]，引起多酚得率下降。

圖6 吐溫80質量分數對多酚得率的影響Fig.6 Effect of Tween 80 mass fraction on polyphenol yield

2.2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響

超聲溫度對多酚得率的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

由圖7可知，多酚得率在25℃～45℃時，隨溫度的升高而升高，當溫度達到45℃時，多酚得率達到峰值，呈現此變化趨勢的原因可能是淀粉加速破裂加快了多酚物質溶出以及吐溫80分子的熱運動加劇有利于對多酚的浸提；繼續升高溫度多酚的得率反而下降，其原因可能是由于高溫破壞了多酚的結構且會使溶劑蒸發，導致料液比發生變化，多酚得率減少。因此選擇超聲溫度45℃較為適宜。

2.2.1.3 超聲時間對多酚得率的影響

超聲時間對多酚得率的影響見圖8。

圖8 超聲時間對多酚得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

由圖8可知，在超聲時間為0～20 min時，多酚得率大幅度增加，呈現此趨勢可能是由于延長超聲時間，超聲波的機械作用加速多酚物質的溶出，使多酚得率增加；超聲時間在20 min時，多酚得率達到最高點；之后再延長超聲時間，多酚得率急劇下降，可能是因為多酚分子結構不穩定，在超聲波的空化作用產生的羥基自由基的作用下使得多酚氧化速率加快[29]，造成多酚物質的得率降低，與此同時長時間暴露于空氣中的多酚易于被氧化和分解。故選取20 min為最佳超聲提取時間。

2.2.1.4 料液比對多酚得率的影響

料液比對多酚得率的影響見圖9。

圖9 料液比多酚對得率的影響Fig.9 Effect of material liquid ratio on polyphenol yield

由圖 9 可知，料液比在 1∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）時，發芽小米粉中多酚的得率因提取溶劑用量的增多而增加，料液比為 1∶15（g/mL）時，多酚得率最高；當溶劑用量繼續增加時，多酚得率反而降低，這可能是在此條件下提取溶劑的濃度梯度達到極限值。提取原料和提取溶劑的濃度梯度是提取物溶出的動力，較大的濃度梯度有利于提取物的溶出，但當此濃度梯度達到一定極限時，繼續增加濃度梯度對提取物的溶出反而起抑制作用[30]，因此料液比選擇 1∶15（g/mL）最合適。

2.2.2 多酚提取優化試驗

響應面設計及結果如表6所示。

表6 響應面試驗結果Table 6 Response surface test results

用Design Expert10.0軟件對此模型進行分析，經擬合后得到該模型的回歸多項式方程：Y=1.97-0.089A-0.13B-0.056C+0.066D+0.057AB-0.11AC-0.18AD+0.26BC-0.082BD+0.027CD-0.34A2-0.36B2-0.38C2-0.27D2。

方差分析結果見表7。

由表7可知，此提取模型的P值小于0.000 1，說明該模型為極顯著，適用于發芽小米多酚提取過程；失擬誤差項P值為0.190 4>0.05，說明其為不顯著，即模型與試驗值的誤差較小；其決定系數R2=0.964 5，說明發芽小米多酚提取得率的試驗值與預測值之間有較高的擬合度；Radj2=0.929 1，Rpred2=0.815 9，兩者的差異較小，表明此模型可較好的描述各因素與響應值之間的關系；信噪比為17.436大于4，即表示該模型可以用于預測。此二次回歸模型中因素C、D、AC對多酚得率的影響顯著；A、AD對多酚得率的影響為高度顯著；B、BC、A2、B2、C2、D2對多酚得率的影響為極顯著；因素AB、BD、CD對多酚得率的影響為不顯著。各因素的均方值可以反映出試驗因素對響應值多酚得率的重要性，均方值越大，表明對響應值的影響程度越大。從表7可得對響應值影響大小的因素依次為B>A>D>C。

表7 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗Table 7 Variance analysis and significance test of regression equation

用響應面軟件得到各因素之間交互作用強弱的曲面圖和等高線圖，見圖10。

圖10 各因素兩兩之間交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.10 Surface diagram and contour map of the interaction between two single factors

由圖10依據等高線圖的形狀可以較為清晰觀察出響應值交互作用的顯著性，AC、AD、BC為橢圓形表示交互作用顯著，AB、BD、CD近似為圓形表示交互作用不顯著。

2.2.3 驗證試驗

依據響應面預測結果，最佳工藝條件：吐溫80質量分數9%、超聲溫度42℃、超聲時間19 min、料液比1∶12.5（g/mL），在此條件下得到發芽小米多酚得率為1.99 mg/g，與預測值接近。

3 結論

本文以發芽小米為研究對象，采用超聲輔助表面活性劑法提取發芽小米中的GABA和多酚物質。以吐溫80水溶液作為提取劑，在料液比1∶18（g/mL），吐溫80質量分數6%，超聲功率為126 W，超聲時間25 min，超聲溫度35℃的條件下，發芽小米GABA得率最高，為4.70 mg/g。以吐溫80水溶液和60%的乙醇溶液作為浸提溶劑，通過響應面分析法優化發芽小米多酚提取工藝，結果表明最佳提取工藝條件為吐溫80質量分數為9%、超聲溫度為42℃、超聲時間為19 min、料液比為1∶12.5（g/mL）時，多酚得率為 1.99 mg/g。本研究對發芽作物活性物質的提取工藝進行優化，在本研究中首次將吐溫80應用于發芽小米GABA和多酚的提取，并采用超聲予以輔助，有效提升了GABA和多酚的得率，可為發芽產品以及活性物質的開發利用提供理論依據。