紅曲橙色素與紅曲黃色素定量分析方法改進(jìn)

楊曼紅，郭佳，楊露，朱效珍，王晶，陳勉華

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

紅曲是由紅曲菌在大米等基質(zhì)上經(jīng)過(guò)固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵形成的，因富含色澤深紅的紅曲色素成分而得名[1]。將固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵的紅曲進(jìn)行色素的提取和噴霧干燥之后得到的紅曲色素稱之為紅曲紅，將在大米基質(zhì)上經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵得到的紅曲產(chǎn)品稱之為紅曲米。紅曲色素在中國(guó)有上千年的食用歷史，被廣泛應(yīng)用于以火腿為代表的肉制品著色和以紅腐乳為代表的發(fā)酵豆制品著色[2-3]。食品著色用紅曲中的色素成分復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道已完成結(jié)構(gòu)解析的紅曲色素超過(guò)60種，其中較為常見(jiàn)的紅曲色素主要為橙色的紅斑紅曲素（rubropunctatin，O1） 和紅曲玉紅素（monascorubrin，O2）；黃色的紅曲素（monascin，Y1）和安卡紅曲黃素（ankaflavin，Y2）；紅色的紅斑紅曲胺（rubropunctamine，R1）和紅曲玉紅胺（monascorubramine，R2）[4]。

紅曲色素種類多樣，根據(jù)顏色可大致分為紅、橙、黃三大類[5]。紅曲橙色素O1和O2是紅曲色素中最常見(jiàn)且含量很高的兩種橙色素，紅曲橙色素可通過(guò)還原反應(yīng)生成紅曲黃色素，也可與氨基酸或其他含氮化合物發(fā)生胺化反應(yīng)生成紅色素[6-7]。研究表明Y1和Y2兩種紅曲黃色素具有明確的抗炎活性[8-9]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Y1和Y2具有減肥、降血脂、降血糖和改善動(dòng)脈粥樣硬化病變的功效[10-11]。雖然紅曲色素包含多種色素成分，但目前紅色調(diào)在食品著色方面應(yīng)用最廣。GB 1886.19—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》和GB 1886.181—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅》關(guān)于紅曲米和紅曲紅的標(biāo)準(zhǔn)均傾向于將紅曲紅色素作為主要測(cè)定指標(biāo)：采用70%乙醇作為提取溶劑最適合紅曲紅色素的提取，紅曲米和紅曲紅的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為505 nm和（495±10）nm，接近于多種紅曲紅色素的最大吸收波長(zhǎng)。GB 1886.66—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲黃色素》中有關(guān)紅曲黃色素的描述是以紅曲米為原料，經(jīng)堿液洗脫，分離制得紅曲紅（或直接以紅曲紅為原料），經(jīng)硫化物磺化、干燥制成的紅曲黃色素。這種紅曲黃色素為化學(xué)改性色素，易溶于水，最大吸收波長(zhǎng)（476±10）nm。

紅曲米中的色素成分復(fù)雜，目前對(duì)于紅曲米中紅曲色素的提取方面應(yīng)用比較廣泛的是有機(jī)溶劑浸提法，常用的有機(jī)溶劑為乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。提取溶劑的選擇和提取方法的優(yōu)化是準(zhǔn)確定量分析的重要前提[12]。超聲波、微波等輔助提取方式，既可節(jié)約溶劑，又可同時(shí)避免溫度升高影響目標(biāo)提取物的穩(wěn)定性[13]。目前對(duì)于紅曲色素的定量分析普遍采用分光光度法，通過(guò)測(cè)定400 nm～410 nm、460 nm～470 nm和500 nm～510 nm波長(zhǎng)范圍的色價(jià)，分別代表黃、橙、紅三大類色素的含量[14]。其他分析方法還包括薄層色譜法、高效液相色譜法以及液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等[15-16]。

本研究以紅曲紅色素色價(jià)定量分析普遍采用的70%乙醇提取溶劑為參比，通過(guò)分光光度法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和硅膠柱層析法，綜合比較不同提取溶劑對(duì)紅曲米中紅曲橙色素和紅曲黃色素的提取率，在此基礎(chǔ)上，建立了紅曲橙色素和紅曲黃色素快速準(zhǔn)確的高效液相色譜定量分析方法，可為富含天然紅曲橙色素和紅曲黃色素新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

古田紅曲米：市售；6種色素標(biāo)準(zhǔn)品（R1、R2、Y1、Y2、O1、O2）：天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程發(fā)酵食品與微生物資源開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室分離制備；甲醇、乙醇、石油醚（petroleum ether，PE）、乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）（均為分析純）：天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；乙腈、甲酸（色譜級(jí)）：天津市康科德科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1260）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Agilent 8453）：安捷倫科技有限公司；離心機(jī)（TDZ5-WS）：湘儀離心機(jī)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGG-107-2BS）：天津天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲色素的提取

將紅曲米打磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取5 g紅曲米粉，按照料液比1∶20（g/mL）分別加入100 mL的70%乙醇、無(wú)水乙醇、70%甲醇、無(wú)水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（體積比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（體積比 2∶1）、二氯甲烷 7種溶劑，超聲輔助提取1 h，3 500 r/min離心10 min，隨后吸取上清液200 μL用于檢測(cè)色價(jià)及紅曲色素含量，并將剩余上清液于60℃烘干至恒重得到紅曲色素粗提物。

1.3.2 色價(jià)的檢測(cè)

用移液器準(zhǔn)確吸取上清提取液，加入對(duì)應(yīng)的70%乙醇、無(wú)水乙醇、70%甲醇、無(wú)水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（體積比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（體積比 2∶1）、二氯甲烷7種提取溶劑進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度使其OD值控制在0.2～0.8之間，并以對(duì)應(yīng)的提取溶劑做空白對(duì)照，設(shè)定385 nm（代表黃色素）、470 nm（代表橙色素）、505 nm（代表紅色素）作為色價(jià)檢測(cè)波長(zhǎng)。色價(jià)計(jì)算公式如下。

式中：S為色價(jià)，U/g；A為稀釋后的吸光度；V為樣品提取液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；n為提取液的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 高效液相色譜法定量分析紅曲色素成分

用移液槍準(zhǔn)確吸取100 μL待檢提取液，揮干溶劑，加入乙腈復(fù)溶后進(jìn)行適當(dāng)稀釋。用0.22 μm有機(jī)濾膜將復(fù)溶后的提取液過(guò)濾，收集于進(jìn)樣瓶中待檢。

色譜柱：COSMOSIL Cholester（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A（0.1%甲酸水）和B（乙腈）。二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：410 nm；柱溫：（25.0±0.8）℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 紅曲色素高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution of HPLC for separation of Monascus pigments

色素混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取6種色素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC檢測(cè)純度>95%）各5 mg于樣品瓶中，加入1 mL乙腈充分溶解，從6個(gè)樣品瓶中各吸取100 μL加入一個(gè)新樣品瓶中，再加入400μL乙腈即得500μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，依次稀釋得到6種色素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為 100 、50 、25 、10 μg/mL。經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣20 μL檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種色素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及其線性范圍。R1：y=42.96x-302，R2=0.999；R2：y=14.99x-138，R2=0.999；Y1：y=35.59x+68.10，R2=0.998；Y2：y=27.92x+64.74，R2=0.999；O1：y=43.15x+47.86，R2=0.997；O2：y=44.77x+17.32，R2=0.999。6 種紅曲色素在 10 μg/mL～500 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.3.4 硅膠柱層析分離富集不同色素組分

樣品預(yù)處理：將5 g原料紅曲米提取得到的全部或部分紅曲色素粗提物加入二氯甲烷進(jìn)行溶解，隨后加入相同質(zhì)量的硅膠，55℃烘干至粉末狀備用。

裝柱：預(yù)處理樣品與柱層析硅膠按照1∶50（g/g）的比例，采用干法裝柱，加入少許石油醚使硅膠完全被浸沒(méi)，平衡30 min后用氣囊加壓壓平硅膠表面。打開(kāi)層析柱下方端口將內(nèi)部溶液排出，隨后裝入預(yù)處理樣品。依次使用二氯甲烷、甲醇洗脫色素樣品，樣品各組分在洗脫液的作用下被依次洗脫，分別收集目標(biāo)色層的色素洗脫液，旋蒸烘干后得到目標(biāo)色素提取物，并測(cè)定其質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲色素色價(jià)檢測(cè)結(jié)果

利用紫外可見(jiàn)分光光度法評(píng)價(jià)不同提取溶劑對(duì)紅曲色素色價(jià)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑對(duì)紅曲色素色價(jià)的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on color value of Monascus pigments

由圖1可知，70%乙醇提取液總色價(jià)為11 393 U/g（其中黃色素5 124 U/g，橙色素2 526 U/g，紅色素3 743 U/g），是無(wú)水乙醇提取液總色價(jià)的55%；70%甲醇提取液總色價(jià)為9 026 U/g（其中黃色素3 440 U/g，橙色素2 881 U/g，紅色素2 705 U/g），是無(wú)水甲醇提取液總色價(jià)的51%。以70%乙醇提取溶劑為參比，極性降低的無(wú)水乙醇大幅提高紅曲色素的總色價(jià)，但更低極性的石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合溶劑或單一溶劑提取物的紅曲色素的紅曲色素總色價(jià)均明顯低于無(wú)水乙醇溶劑提取物的紅曲色素的總色價(jià)。由于紅曲色素粗提物組分復(fù)雜，紅、橙、黃三類色素在較寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)均存在很強(qiáng)的吸收。采用分光光度法，用特定波長(zhǎng)下的吸光度分別代表不同色素含量的分析方法，必然會(huì)干擾三類色素的準(zhǔn)確定量。因此，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)不同提取溶劑對(duì)紅曲橙色素與紅曲黃色素的提取量的影響，需要進(jìn)一步的HPLC定量分析。

2.2 高效液相色譜法定量檢測(cè)結(jié)果

6種常見(jiàn)天然紅曲色素分子信息和對(duì)應(yīng)的HPLC保留時(shí)間如表2所示。采用HPLC法定量分析比較不同提取溶劑得到的紅、橙、黃三類紅曲色素的峰面積，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑紅曲色素峰面積的比較Fig.2 Comparison of peak area of Monascus pigments extracted with different solvents

表2 6種紅曲色素的分子信息和高效液相色譜保留時(shí)間Table 2 Molecular information and retention time of six Monascus pigments by HPLC

比較分光光度法（圖1）和HPLC法（圖2）評(píng)價(jià)不同溶劑對(duì)紅曲米中的紅曲色素提取量影響的結(jié)果差異明顯：分光光度法測(cè)得無(wú)水乙醇提取液的紅曲橙色素的色價(jià)最高；而HPLC法測(cè)得使用PE∶EA（體積比2∶1）、PE∶DCM（體積比 2∶1）和 DCM 進(jìn)行提取，得到的紅曲橙色素O1和O2的峰面積約為無(wú)水乙醇提取液的 2 倍，同時(shí) PE∶EA（體積比 2∶1）和 PE∶DCM（體積比2∶1）這兩組提取溶劑提取得到的紅曲紅色素R1和R2的峰面積大幅度下降，且各種提取溶劑對(duì)紅曲黃色素提取量的影響不明顯。

紅曲橙色素 O1、O2及紅曲紅色素 R1、R2在470 nm和505 nm均有較大色譜吸收，如果僅以470 nm代表紅曲橙色素，以505 nm代表紅曲紅色素進(jìn)行色價(jià)測(cè)定，當(dāng)紅曲色素粗提液中包含豐富的紅曲橙色素和紅曲紅色素時(shí)，由于兩類紅曲色素具有重疊的吸收光譜區(qū)域，色價(jià)定量的方法誤差較大。經(jīng)HPLC定量分析可知，以乙醇為提取溶劑紅曲橙色素提取量遠(yuǎn)低于石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或單一溶劑提取。這可能與乙醇能夠萃取得到更多種類紅曲紅色素有關(guān)。多數(shù)已知結(jié)構(gòu)的紅曲紅色素與R1、R2具有相似的特征吸收光譜，大量未被HPLC檢測(cè)到的多種紅曲紅色素在470 nm也有較強(qiáng)的色譜吸收，導(dǎo)致無(wú)水乙醇提取的紅曲橙色素色價(jià)雖然最高，但與HPLC定量分析測(cè)得的紅曲橙色素O1和O2峰面積不高的結(jié)果矛盾。相關(guān)研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，O1和O2在甲醇溶液中不穩(wěn)定，可與甲醇反應(yīng)生成具有黃色熒光的兩種新的紅曲橙色素monasphilol-methoxy A和monasphilol-methoxy B，該研究使用HPLC分析了二氯甲烷、乙腈等6種有機(jī)溶劑對(duì)紅曲橙色素O1和O2提取率的影響，結(jié)果表明二氯甲烷對(duì)O1和O2的提取率較高，與本研究結(jié)果一致。

不同提取溶劑提取紅曲色素的HPLC色譜圖與光譜圖如圖3所示。

圖3 不同提取溶劑提取紅曲色素的HPLC色譜圖與光譜圖Fig.3 HPLC profiles and spectrograms of Monascus pigments extracted with different solvents

采用方法1.3.3的HPLC檢測(cè)方法使紅、橙、黃三類6種色素均獲得了很好的分離度。圖3所示的紅曲色素的光譜圖顯示：紅曲紅色素R1、R2的較大吸收波長(zhǎng)分別為 302、415、525 nm；紅曲黃色素 Y1、Y2的較大吸收波長(zhǎng)為230 nm和390 nm；紅曲橙色素O1、O2在472 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道的紅曲色素的吸收波長(zhǎng)一致[19-20]。SN/T 3843—2014《出口食品中紅曲色素的測(cè)定》采用高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)R2、Y1、Y2以及O2共4種色素，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30℃；GB 5009.150—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中紅曲色素的測(cè)定》推薦無(wú)水乙醇或80%乙醇為提取溶劑，規(guī)定了食品中R2、Y1和O2 3種色素的高效液相色譜測(cè)定方法，R2的檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm，Y1和O2的檢測(cè)波長(zhǎng)為390 nm，柱溫40℃。本研究以石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或單一溶劑優(yōu)化的提取溶劑可大幅度提高紅曲橙色素的得率。本研究采用優(yōu)化后的梯度洗脫方案，選取紅、橙、黃三類色素均有較強(qiáng)吸收的410 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，柱溫25℃，實(shí)現(xiàn)了30 min內(nèi)同時(shí)完成6種紅曲色素的快速定量檢測(cè)。

圖3顯示，70%乙醇提取液色調(diào)偏紅，DCM提取液顏色為橙黃色，PE∶EA（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比2∶1）提取液偏黃色，說(shuō)明70%乙醇提取液紅色素組分高于其他3種提取溶劑。優(yōu)化提取溶劑一方面要考慮盡可能提高目標(biāo)紅曲色素的提取率，同時(shí)降低非目標(biāo)色素的提取率，降低樣品前處理難度，減輕復(fù)雜的生物雜質(zhì)對(duì)色譜柱的污染。DCM、PE∶EA（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比2∶1）3組提取溶劑獲得的紅曲橙色素O1和O2峰面積相近，但DCM提取得到的紅曲紅色素R1和R2峰面積明顯高于另外2組提取溶劑。

2.3 硅膠柱層析法分離富集不同紅曲色素組分

紅曲色素粗提物裝入硅膠柱后，二氯甲烷洗脫液首先洗脫出紅曲橙色素與紅曲黃色素組分，然后使用甲醇洗脫液將紅曲紅色素組分洗脫出來(lái)。分別收集二氯甲烷與甲醇洗脫液，旋干洗脫液后分別稱重，結(jié)果如表3所示。

表3 柱層析分離紅曲色素粗提物組分Table 3 Separation of crude extract of Monascus pigments by column chromatography

5 g紅曲米樣品使用70%乙醇提取獲得的紅曲色素粗提物質(zhì)量為1 156 mg，取其中731 mg的紅曲色素粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，由表3可知，70%乙醇所提紅曲粗提物中紅曲橙色素與紅曲黃色素組分質(zhì)量是最低的，紅曲紅色素組分最高。說(shuō)明70%乙醇對(duì)紅曲米進(jìn)行提取時(shí)，對(duì)種類復(fù)雜的醇溶性紅曲紅色素的提取率最高，對(duì)紅曲橙色素與紅曲黃色素的提取率最低，該方法不適合對(duì)紅曲橙色素與紅曲黃色素進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。DCM、PE∶DCM（體積比 2∶1）、PE∶EA（體積比2∶1）提取的紅曲色素粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離得到的紅曲橙色素與紅曲黃色素組分占比是用70%乙醇提取時(shí)的3倍左右，而紅曲紅色素組分明顯下降。DCM、PE∶EA（體積比 2∶1）與 PE∶DCM（體積比 2∶1）提取溶劑均可明顯提高紅曲橙色素與紅曲黃色素提取率，且后兩種提取溶劑得到的紅曲紅色素組分質(zhì)量更低，與圖 3 中 DCM、PE∶DCM=2∶1（體積比 2∶1）與 PE∶EA=2∶1（體積比2∶1）提取溶劑所提樣品色調(diào)分別呈現(xiàn)偏紅和偏黃的現(xiàn)象吻合，且 PE∶DCM（體積比 2∶1）與 PE∶EA（體積比2∶1）所提紅曲色素粗提物質(zhì)量較低，而紅曲色素粗提物中紅曲橙色素與紅曲黃色素組分占比較高說(shuō)明非目標(biāo)色素雜質(zhì)的提取量較低。因此，選擇PE∶DCM（體積比 2∶1）與 PE∶EA（體積比 2∶1）進(jìn)行紅曲橙色素和紅曲黃色素的定量分析，不僅可以明顯提高紅曲橙色素、紅曲黃色素的提取率，還可大幅度減少以紅曲紅色素為代表的非目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的提取率，更有益于準(zhǔn)確和快速地定量分析紅曲橙色素與紅曲黃色素的含量。

3 結(jié)論

本研究以70%乙醇提取溶劑為參比，探究不同提取溶劑對(duì)紅曲橙色素和紅曲黃色素提取效果的影響，通過(guò)分光光度法、高效液相色譜和柱層析分析，優(yōu)化了提高紅曲橙色素和紅曲黃色素得率的提取溶劑。結(jié)果表明 PE∶EA=2∶1（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比 2∶1）和DCM這3種提取溶劑顯著提高了紅曲橙色素的提取得率。PE∶EA（體積比 2∶1）與 PE∶DCM（體積比 2∶1）兩組溶劑的提取可大幅度減少紅曲紅色素組分等非目標(biāo)檢測(cè)物的提取率。建立了30 min內(nèi)快速定量分析紅曲橙色素和紅曲黃色素的HPLC檢測(cè)方法，且6種紅曲色素在10 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。這可為開(kāi)發(fā)富含天然紅曲橙色素和紅曲黃色素的新產(chǎn)品提供可靠的技術(shù)平臺(tái)，為紅曲橙色素與紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。