產纖維素酶霉菌篩選及發酵條件優化

干建松

（1.江蘇財經職業技術學院 糧食與食品藥品學院，江蘇 淮安 223003；2.中國礦業大學 化工學院，江蘇 徐州 221116）

農作物秸稈是世界上最豐富的纖維素類可再生資源[1-2]，同時也是世界上年產量最多的農業副產品，據不完全統計，2014～2018年，中國秸稈年均產量高達6.537 8×108t，其中谷類、麥類和玉米秸稈產量分別占32.3%、22.7%和45.0%[3-4]。在我國，大量秸稈往往被就地焚燒，不但污染了環境，而且造成秸稈資源的浪費。近年來，雖然開發出一些新的秸稈利用技術，但是由于技術瓶頸，秸稈的利用仍然存在轉化利用率低、時間長、成本偏高等問題。秸稈的主要成分纖維素、木質素等，是可再生資源的重要組成部分。纖維素的降解和轉化利用可以通過纖維素酶的作用進行，不但能耗低，而且反應溫和，且不像化學方法那樣會產生對環境有污染的物質。

我國是農業生產大國，但在秸稈利用方面較差，開發利用較少[5]，纖維素酶能將天然纖維素降解，生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖，高產纖維素酶微生物的篩選對解決這些問題十分重要[6-8]，然而目前制約纖維素材料轉化為乙醇并實現產業化的關鍵因素之一是纖維素酶效率低下，從而造成生產成本過高[9]。因此，篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降解微生物菌株及相關研究是當前研究的熱點和難點[10-11]。若能將秸稈合理利用，其潛力巨大，前景廣闊[12-13]。

國內外對高產纖維素酶的微生物開展了大量的研究工作，左勇等[14]以羧甲基纖維素鈉為培養基的唯一碳源，從酒糟中分離純化出一株具有產纖維素酶能力的維氏芽孢桿菌P-7；傅科鶴等[15]從土壤中分離純化獲得一株高產纖維素酶的菌株TW063-3，通過形態學結合分子生物學鑒定得出，該菌株為草酸青霉，經過試驗優化，酶活比優化前提高了34.1%；何深宏等[16]從牛糞堆肥樣品中分離得到的57株菌株中篩選出10株有較高纖維素酶活力，其中菌株X10纖維素酶活力最高，為31.9 U/mL，菌株X10鑒定為解淀粉芽孢桿菌；蘭時樂等[17]從腐木上分離并篩選出1株具有較高纖維素酶活力的菌株TP01，并將其鑒定為綠色木霉，對該菌株進行誘變處理，獲得了1株高產纖維素酶的突變菌株TP1202，發現TP1202對纖維素的降解活性高于野生型菌株TP01；王靖等[18]從快速腐爛的苧麻基質中篩選到1株產纖維素酶活力較高的菌株F1-1，分析該菌株的遺傳背景，并對其產酶條件進行了優化；但由于各種原因，均未能應用。本文利用傳統微生物學方法從自然界篩選出一株性能穩定、高產纖維素酶的纖維素降解菌，并對其產酶條件進行優化，旨在為其實際應用提供一定的技術支撐。對于木質纖維原料的應用工藝的研究和開發，對于實現經濟可持續性發展和環境保護有著極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

磷酸二氫鉀（分析純）：宜興市第二化學試劑廠；蛋白胨（生物試劑）：上海東海制藥股份有限公司；剛果紅、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）（均為分析純）：中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；硫酸鎂（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）：湖州生物化學有限公司；無水乙醇（分析純）：江蘇永豐化學試劑有限公司；無水葡萄糖（分析純）：成都化學試劑廠；酒石酸銨（分析純）：浙江寧?？h有機化工廠；過氧化氫（分析純）：無錫市亞盛化工有限公司；溶壁酶（生物試劑）：廣東微生物研究所；纖維素酶（≥300 U/mg）：德國SERVA公司；崩潰酶（≥3 U/g）：芬卡國際貿易（上海）公司。

1.1.2 霉菌自然樣本采集

除去地表植被和枯枝落葉后，取表面4 cm～5 cm左右的表土，來源于江蘇淮安清江浦區富麗花園西部柳樹灣保護區樹林。

1.1.3 培養基

富集培養基、種子培養基：羧甲基纖維素鈉10.00g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂0.50 g，水1 L，pH自然。

篩選培養基：CMC-Na 10.00 g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00g，硫酸鎂0.50g，剛果紅0.03g，瓊脂18.00g，水1 L，pH自然。

產酶發酵培養基：秸稈粉10.00 g，硫酸銨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂0.50 g，吐溫-80 5 mL，水1 L，pH 自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g（切片，沸水煮30 min，6層紗布過濾），葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水硫酸鎂0.15 g，瓊脂18 g，補水至水1 L，pH自然。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫培養箱（DNP-9052）：上海精宏實驗設備有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-6）：金壇市富華電器有限公司；自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX型）：上海申安醫療器械廠；電子天平（FA2004）：上海精密科學儀器有限公司；恒溫搖床（DHZ-C）：江蘇太倉市實驗設備廠；分光光度計（721型）：上海棱光技術有限公司；搖床（MJ-106）：上海福瑪實驗設備有限公司；冰箱（BCD-215C型）：青島海爾冷凍柜總公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

1.3.1.1 富集培養

取10 g的土壤樣品加入裝有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，150r/min，28℃振蕩20min，制成土壤懸液，吸取3mL土壤懸液置于富集培養基中，150r/min，28℃，培養2 d。

1.3.1.2 菌株初步篩選

將富集培養后的菌懸液，按10倍法稀釋，稀釋至10-8。將上述稀釋液（10-5～10-8）涂布于篩選培養基平板，28℃培養3 d，觀察是否產生透明圈。挑取有透明圈的菌落，用接種針在平板上劃線，再次分離篩選，重復3次～4次。平板劃線分離后，挑取單菌落接入斜面，28℃恒溫培養2 d～3 d后，于4℃冰箱保存備用。

1.3.1.3 菌株復篩

初篩后菌株平板培養3 d后，接入PDA培養基活化，而后接入產酶發酵培養基中，28℃、150 r/min發酵3 d，后每隔24 h測定一次酶活力。選取發酵酶活力高的菌株進行后續試驗。

1.3.1.4 纖維素酶高產菌株誘變

種子液培養2 d，過濾收集菌絲體，刮取2勺菌絲體于酶解液中，28℃，220 r/min酶解2 h～3 h，從2 h開始鏡檢觀察原生質體制備情況，酶解結束后，過濾收集原生質體濾液，5 000 r/min離心10 min，收集原生質體，用0.6 mol/L氯化鈉沖洗2遍并重懸至10 mL，分別稀釋50倍、100倍備用。將稀釋好的原生質體溶液分別取 100 mL 涂布，進行 0、1、2、3、4、5 min 紫外照射，每個時間梯度2個平板，28℃培養，分別記錄單菌落數量，繪制致死率曲線，確定最佳誘變時間。挑取單菌落進行后續發酵驗證。所有試驗均重復3次，取平均值。

1.3.2 纖維素酶酶活力的測定

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的測定

將無水葡萄糖粉末置于105℃烘箱烘至恒重，精確稱取0.108 g葡萄糖，蒸餾水定容至100 mL，配制濃度6 μmol/mL葡萄糖標準溶液備用。分別取6 μmol/mL葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于具塞試管中，加蒸餾水定容至2.5 mL，分別加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑[19]，沸水浴中加熱5 min，流水冷卻。再用蒸餾水稀釋10倍，混勻后以空白管為對照，530 nm測OD值。以葡萄糖微摩爾數為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.3.2.2 粗酶液的制備

從冰箱中取出備用的菌株，接入PDA培養基活化，而后接入產酶發酵培養基中，在28℃、150 r/min搖床產酶發酵，取發酵液2 000 r/min離心l5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.2.3 酶活力測定

根據葡萄糖回歸方程和測得的OD值，可由公式（1）計算纖維素酶活力。酶活力單位（U）：標準狀態下，每分鐘從底物溶液中釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量稱為一個酶活力單位。這里所指標準狀態通常是指酶反應最佳條件。

式中：10為酶與底物作用時間，min。

1.3.2.4 CMC法測纖維素酶活力

取含有0.05 mol/L CMC-Na的醋酸緩沖液1 mL于5 mL離心管中，加入粗酶液0.50 mL，50℃酶解10 min，1 mL 10%NaOH終止反應，加入1.50 mL DNS試劑，沸水加熱5 min，流水冷卻，稀釋10倍，530 nm測OD值，根據葡萄糖標準曲線，求得每毫升酶液酶解產生的葡萄糖摩爾數[20-22]，空白為0.50 mL粗酶液，先經1 mL 10%NaOH處理，其他操作同樣品的測定。

1.3.2.5 濾紙酶（filter paper activity，FPA）活力測定

于試管中加pH4.5檸檬酸緩沖液1mL，再加入1張卷曲的濾紙條（1 cm×3 cm），50℃預熱 5 min，在試管中加入0.5 mL酶液，50℃保溫10 min，1 mL 10%NaOH終止反應，加入1.50 mL顯色液，再沸水浴5 min，流水冷卻終止反應，用蒸餾水稀釋10倍，同時用失活的酶做對照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活。530 nm測OD值，根據葡萄糖標準曲線得到酶單位[21]。FPAase酶活力的定義：1個酶活力單位是指在50℃與pH4.8的條件下，每分鐘分解產生1 μmol葡萄糖所對應的酶量。

1.3.2.6 外切型-β-葡聚糖（circumscribed type-βglucanase，C1）酶活力的測定

取1%的微晶纖維素溶液1.0 mL作為底物，溶劑為0.05 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液，加入0.5 mL適當稀釋的纖維素酶溶液，于50℃下反應10 min后，立即用1 mL 10%NaOH終止反應，加入1.50 mL DNS試劑，沸水浴5 min顯色，流水冷卻終止反應，用蒸餾水稀釋10倍，530 nm測OD值，并從葡萄糖標準曲線得出相應的葡萄糖濃度，折算成酶單位。同時用失活的酶作對照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均與上面步驟一致。

1.3.2.7 β-葡萄糖苷（β-glucosidase，BG）酶活力的測定

取1%的水楊甘（素）溶液1.0 mL作為底物，溶劑為0.05 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液，加入0.5 mL適當稀釋的纖維素酶溶液，50℃反應10 min，1 mL 10%NaOH終止反應，加入1.50 mL DNS試劑，沸水浴5 min顯色，流水冷卻終止反應，用蒸餾水稀釋10倍，530 nm測OD值，并從葡萄糖標準曲線得出相應的葡萄糖濃度，折算成酶單位。同時用失活的酶作對照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均與上面步驟一致。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 培養基試驗

采用菌種復篩發酵條件，分別將氮源調整為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、尿素、酵母膏，最終含氮量為0.8%，以研究不同氮源對菌株產酶的影響；分別將誘導物（用量10 g/L）調整為玉米芯提取物、秸稈粉、麩皮，以研究不同物質對菌株誘導產酶的影響。

1.3.3.2 單因素爬坡試驗

將最適氮源的質量濃度調至1 g/L～3 g/L，最適誘導物的質量濃度調至5 g/L～15 g/L，磷酸二氫鉀質量濃度 0.5 g/L～1.5 g/L、硫酸鎂 0～1 g/L，吐溫-80 0～10 mL/L，以研究氮源、誘導物、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、吐溫-80對菌株產酶的影響。試驗設計見表1。

表1 最陡爬坡試驗設計Table 1 Experimental design of steepest climbing

1.3.4 中心組合設計試驗

根據單因素爬坡試驗結果，對秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80進行Box-Benhnken試驗，每個因素取3個水平，響應值為纖維素酶活力，試驗設計見表2。

表2 響應面試驗設計Table 2 Response surface experiment design

1.4 數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示（n=3），采用origin 8.0和Design-expert軟件對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

從土壤樣本中共篩得到8株菌株，其中有3株（S-1、S-2、S-3）可在初篩培養基中培養后產生透明圈，3株菌菌絲和孢子的形態如圖1所示。

圖1 3株菌的菌絲、孢子Fig.1 Hyphae and spores of 3 strains of bacteria

2.2 纖維素酶活力

根據葡萄糖標準溶液在OD530的吸光值，繪制標準曲線（圖 2），線性回歸方程：y=0.077x-0.020，R2=0.997。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Glucose standard curve

通過液體產酶發酵試驗，獲得了菌株S-1、S-2、S-3的4種酶活力，結果如表3所示。

表3 不同菌株纖維素酶活力Table 3 Cellulase activity of different strains U/mL

綜合比較S-1、S-2和S-3試樣的各類酶活力，可知S-2菌株試樣的酶活力整體上高于另外兩株試樣的酶活力，因此選擇S-2菌株作為后繼研究菌株。

2.3 高產菌株誘變及遺傳穩定性

2.3.1 高產菌株紫外誘變

記錄紫外誘變 0、1、2、3、4、5 min 后單菌落的數量，繪制致死率曲線，結果如圖3所示。

圖3 致死率曲線Fig.3 The lethality curve

由圖3可知，照射4 min時，致死率可達70%以上，因此確定4 min為最佳誘變時間。紫外誘變后選取水解圈直徑較大的菌株進行擴大培養，分別編號為SUV2-1、SUV2-2、SUV2-3、SUV2-4，SUV2-5，SUV2-6，進行發酵產酶試驗3次，測定平均酶活力，結果如圖4～圖7所示。

由圖4～圖7可知，SUV2-1產C1酶活力最大，可達0.64 U/mL，SUV2-2產BG酶活力最大可達1.52 U/mL，SUV2-3產CMC酶和FPA酶活力最大，分別達到0.52 U/mL和0.35 U/mL。

圖4 誘變后菌株的CMC酶活力Fig.4 CMC activity of the mutagenized strain

圖5 誘變后菌株的C1酶活力Fig.5 C1 activity of the mutagenized strain

圖6 誘變后菌株的BG酶活力Fig.6 BG activity of the mutagenized strain

圖7 誘變后菌株的FPA酶活力Fig.7 FPA activity of the mutagenized strain

2.3.2 遺傳穩定性試驗

將誘變后的菌株進行傳代培養，菌株的酶活力如表4所示。

表4 傳代培養的4代菌株的活力Table 4 Enzyme activity of the four generations of subcultured strains U/mL

從表3可以看出，SUV2-1菌株4種酶都略有降低，但較為穩定；SUV2-2和SUV2-3兩株菌分別有BG、CMC的最大酶活力，分別為1.48 U/mL和0.52 U/mL但其并不穩定，且其他酶活力并不理想；SUV2-4、SUV2-5、SUV2-6 3株菌酶活力都相對較低。綜上來看，此次紫外誘變SUV2-1菌株酶活力明顯提高，CMC酶活力最大達到0.48 U/mL，相對誘變前提高了9.58%；C1酶活力最大達到0.57 U/mL，相對提高了32.69%；BG酶活力最大達到1.37 U/mL，相對提高了52.60%；FPA酶活力最大達到0.30 U/mL，相對提高了40.93%，且較為穩定。將SUV2-1菌株保藏，進行產酶條件的優化試驗。

2.3.3 單因素試驗結果

單因素試驗結果見圖8～圖11。

由圖8可知，不同氮源對SUV2-1產酶的影響不同，添加蛋白胨效果最佳，酵母膏次之，添加尿素的效果最差。纖維素酶是一種誘導酶，因此在發酵過程中通常需要添加誘導物以提高發酵產酶水平，如圖10可知，使用秸稈粉的CMC酶活力最大達到0.45 U/mL，3種誘導物中最高，C1酶活力最高達到0.45 U/mL，FPA酶活力最高達到0.21 U/mL，BG酶的誘導作用達到最大值0.90 U/mL，效果最為明顯。綜合以上4種酶活力，因此秸稈粉誘導作用更為明顯。

圖8 氮源對發酵產酶的影響Fig.8 Effect of nitrogen source on enzyme production

圖9 誘導物玉米芯提取物對發酵產酶的影響Fig.9 Effect of the inducer corncob extract on enzyme production

圖10 誘導物秸稈粉對發酵產酶的影響Fig.10 Effect of inducer straw powder on enzyme production

圖11 誘導物麩皮對發酵產酶的影響Fig.11 Effect of inducer bran on enzyme production

2.3.4 單因素爬坡試驗

選擇單因素試驗中產酶效果最好的蛋白胨、秸稈粉，以及培養基中其它組分磷酸二氫鉀、硫酸鎂、吐溫-80進行單因素爬坡試驗，結果如圖12～圖16所示。

圖12 蛋白胨對SUV2-1產纖維素酶的影響Fig.12 Effect of peptone on the production of cellulase from SUV2-1

圖13 秸稈粉對SUV2-1產纖維素酶的影響Fig.13 Effect of straw powder on the production of cellulase from SUV2-1

圖14 磷酸二氫鉀對SUV2-1產纖維素酶的影響Fig.14 Effect of potassium dihydrogen phosphate on the production of cellulase from SUV2-1

圖15 硫酸鎂對SUV2-1產纖維素酶的影響Fig.15 Effect of magnesium sulfate on the production of cellulase from SUV2-1

圖16 吐溫-80對SUV2-1產纖維素酶的影響Fig.16 Effect of tween-80 on the production of cellulase from SUV2-1

由圖12～圖16可知，對產酶影響最大的3個因素分別為蛋白胨、秸稈粉和吐溫-80，濃度分別在2、10 g/L和2.5 mL/L時產酶活力最高。

2.3.5 響應面試驗設計優化

使用爬坡試驗中獲得的各因子對應的最適產酶濃度為中心點進行響應面設計并開展試驗，結果如表5所示?；貧w模型方差分析見表6。

表5 響應面試驗結果分析Table 5 Analysis of response surface experiment results

從表6中可以看出，復相關系數R2=96.05%，表明多項式模型方程具有較高的擬合程度，預測值和實測值之間具有較大的相關性；模型F=23.93，P=0.000 2，說明回歸模型是顯著的；失擬項F=0.42，P=0.746 1>0.05，說明失擬項是不顯著的。可以用此模型對產纖維素酶菌株發酵產酶進行分析和預測。經過對試驗數據的回歸分析，得到二次多元回歸方程：Y=0.43+0.023X1+0.024X2+0.013X3+0.031X1X2+0.004545X1X3+0.0006494X2X3-0.031X12-0.027X22-0.035X32。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Regression analysis of variance

根據響應面回歸方程可以利用Design-Expert軟件繪制響應曲面圖，見圖17～圖19。

圖17～圖19直觀地反映了各因素對響應值的影響，比較3組圖可知：圖18中AB對產酶的影響最為顯著，表現為曲線較陡；圖17中AC對產酶的影響較為顯著，表現為曲線有一定陡峭；圖19中BC對產酶的影響最小，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化相對較小。綜上可知：3個因素兩兩之間相互影響的主次關系：AB>AC>BC。

圖17 秸稈粉和吐溫-80含量交互作用對產酶的影響Fig.17 Effect of interaction between straw powder and Tween-80 content on enzyme production

圖18 秸稈粉和蛋白胨含量交互作用對產酶的影響Fig.18 Effect of interaction between straw powder and peptone content on enzyme production

圖19 吐溫-80和蛋白胨含量交互作用對產酶的影響Fig.19 Effect of interaction between Tween-80 and peptone content on enzyme production

2.3.6 驗證試驗

根據Design-Expert軟件預測結果，在秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80含量分別為11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L的最佳條件下進行驗證試驗，3次試驗平均值為0.46 U/mL，與預測值0.454 5 U/mL十分接近，充分說明模型是可靠的。

3 結論

本研究從自然界篩選以及紫外誘變獲取性狀優良的產纖維素酶菌株SUV2-1。結果表明，S-2經誘變后產不同種類纖維素酶（CM酶、FPA酶、C1酶、BG酶）的活力有所不同，可以根據實際應用情況，分別選擇適合的菌株。單因素試驗選擇誘導物時，發現秸稈粉誘導作用較好，其原因有可能是秸稈粉含有的粗纖維高達30%以上，高于玉米芯及麩皮。在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對培養基進行優化，得到菌株發酵最佳條件：秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80含量分別為11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L，產生纖維素酶活力的最大值為0.46 U/mL。本研究為纖維素酶高產菌株的選育建提供了1株良好出發菌株，發酵優化結果為該菌株的后續放大發酵和應用研究奠定了基礎。