外源性硫化氫通過上調SIRT1延緩心肌早衰抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化

劉達，肖婷，梁彪，宋熊，王森，趙俊雄，楊軍△

心血管并發癥已成為目前尿毒癥患者的首要死因，而尿毒癥心肌病（UCM）是各類原因所致的腎功能衰竭后重要的心肌損害表現，心肌纖維化是其常見的病理改變，不僅可影響心臟順應性及左心室舒張功能，嚴重時還可引發惡性心律失常，導致心源性猝死［1］。尿毒癥誘發心肌纖維化的機制目前尚不清楚，同時缺乏具有針對性的防治措施。近年有研究顯示，尿毒癥環境下的心肌過早衰老參與了心肌纖維化的發生機制，且可能與尿毒癥毒素誘發的慢性炎癥反應有關［2-3］。同時，有研究發現沉默信息調節因子-1（SIRT1）在心血管系統中的潛在保護效應可能與其延緩心肌細胞衰老有關［4］。Chen等［5］證實上調SIRT1可抑制炎性因子分泌，改善D-半乳糖誘導的心臟早衰。但SIRT1能否介導尿毒癥心肌纖維化的發生目前尚不明確。既往研究發現，氣體信號分子硫化氫（H2S）可抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體活化，調控炎癥反應［6］，并可抑制細胞應激性早衰，改善糖尿病所致的心肌纖維化［7］，但其能否在尿毒癥導致的心肌纖維化過程中起到保護作用尚有待探討。本研究通過建立UCM大鼠模型，觀察H2S能否抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化，并探討其機制是否與上調SIRT1信號通路進而抑制心肌早衰有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只SPF級，體質量為300~350 g的SD雄性成年大鼠（動物生產許可證號：SYXK湘2015-0002）于溫度適宜、濕度恒定、通氣良好、晝夜12 h交替的南華大學動物實驗中心喂養，自由飲食飲水，干預過程遵守南華大學動物實驗倫理學要求。

1.2 主要試劑及儀器硫氫化鈉（NaHS）、石蠟、中性樹膠購于美國Sigma公司，β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于中國上海碧云天公司；NLRP3、白細胞介素（IL）-1β兔一抗購于美國Cell Signaing Technology公司；SIRT1、P21、P19、P53、GAPDH兔一抗及羊抗兔二抗購于武漢Proteintech公司；恒溫風干箱購于北京六一公司，切片機購于浙江金華實驗儀器廠，化學發光成像儀購于上海伯樂公司。血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測盒購于上海信裕生物科技公司；BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物公司；酶標儀購于美國賽默飛科技公司。

1.3 實驗建模及分組干預大鼠熟悉環境5 d后根據隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、模型組（UCM組）、H2S治療組（UCM+H2S組）和H2S對照組（H2S組），每組12只。UCM組及UCM+H2S組大鼠麻醉后備皮消毒，結扎切除左腎上下1/3，僅保留左腎中間1/3的血流與功能，止血并縫合手術切口，7 d后二次手術將右腎切除，建立5/6腎切除的尿毒癥大鼠模型［8］；而Sham組及H2S組大鼠僅行雙腎游離。術后28 d存活大鼠采血測BUN和Scr，當血BUN和Scr較Sham組升高2~3倍時認為尿毒癥大鼠造模成功［8］。UCM+H2S組和H2S組每日以NaHS溶液50 μmol/kg腹腔注射［9］，共給藥8周，Sham組和UCM組注射同劑量生理鹽水。

1.4 心臟超聲檢測及樣本收集干預結束后麻醉并行心臟超聲檢測大鼠左心室短軸縮短率（LVFS），隨后處死并收取心臟標本。用4%多聚甲醛封存少許心肌組織用做Masson染色。剩余心臟組織立即置于-80℃條件下凍存，用于β-半乳糖苷酶染色及后期的蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平。

1.5 Masson染色法評估心肌纖維化情況取封存的心肌標本經過脫水、石蠟包埋法切制薄片，脫蠟后進行核染液染色。再經過沖洗、復染、脫水晾干、封片后置于光學顯微鏡下觀察，最后使用Image J進行圖像分析，測得藍染面積/視野中總組織面積為膠原容積分數（CVF）。

1.6 免疫組化法檢測心肌Ⅲ型膠原表達取石蠟包埋備用的組織切片，經脫蠟水化、修復抗原、暴露抗原決定簇后，封閉非特異性蛋白。再加Ⅲ型膠原一抗4℃孵育過夜。次日漂洗后孵育二抗，充分漂洗、顯色、脫水以及封片后，光鏡下閱片，陽性反應時組織呈棕色，陽性表達率為視野內棕染面積占總視野面積的比值，Image J軟件進行定量分析。

1.7 β-半乳糖苷酶染色檢測衰老心肌細胞取冰凍的包埋心肌組織，切成約6 μm薄片，室溫入蒸餾水5 min×2次；滴加50 μL β-半乳糖苷酶染色固定液于切片，置于濕盒中，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次；吸去PBS，加適宜量的染色試劑。放于濕盒中，置無二氧化碳環境中37℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×3次；最終緩沖甘油封片后于顯微鏡下觀察，陽性反應時組織細胞呈藍色，陽性表達率為視野內藍染面積占總視野面積的比值，Image J軟件進行定量分析。

1.8 蛋白免疫印跡法測心肌中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達稱取凍存的心肌標本0.2 g，加入裂解液及蛋白酶抑制劑混合后低溫研磨并離心，取上清液，而后采用BCA法定量并配平，最后95℃煮10 min完成蛋白提取。制上層5%濃縮膠、下層10%分離膠電泳分離蛋白后進行轉膜；然后5%脫脂奶粉封閉2 h，SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53一抗稀釋液（1∶500）4℃冰箱孵育過夜；TBST洗膜后用二抗稀釋液（1∶8 000）室溫孵育1 h，再次漂洗后顯影。以Image J軟件處理圖像，計算條帶與GAPDH的灰度值比值。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠存活情況及造模結果術后28 d，40只大鼠存活。UCM組BUN和Scr較Sham組升高2倍以上，提示尿毒癥大鼠造模成功。UCM組與UCM+H2S組，Sham組與H2S組BUN和Scr差異無統計學意義，見表1。藥物干預8周后，Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組分別存活12、7、8、11只大鼠，隨機數字表法每組抽取7只大鼠進行后續實驗。

Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 （±s）

Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 （±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，P＜0.05。

組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F n 12 8 9 11 BUN（mmol/L）11.11±2.43 25.09±7.04a 23.13±6.23a 10.67±1.94 27.000＊Scr（μmol/L）31.75±6.02 109.50±12.45a 106.20±11.69a 32.14±5.61 158.100＊

2.2 各組大鼠心臟超聲LVFS比較Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組LVFS分 別 為0.48±0.04、0.41±0.02、0.47±0.04和0.49±0.02，組間比較差異有統計學意義（n=7，F=6.272，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組LVFS明顯下降（P＜0.05）；與UCM組比較，UCM+H2S組LVFS升高（P＜0.05），見圖1。

2.3 各組大鼠心肌Masson染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心肌CVF（%）分別為20.05±1.77、41.86±3.29、30.50±2.59和21.27±2.40，組間比較差異有統計學意義（n=7，F=46.390，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組大鼠心肌CVF升高（P＜0.05），藍染組織增多；而UCM+H2S組較UCM組大鼠心肌CVF降低（P＜0.05），藍染組織減少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織則均較少被藍染，見圖2。

Fig.1 Ultrasound image of rat heart function in each group圖1各組大鼠心功能超聲圖像

2.4 各組大鼠心肌Ⅲ型膠原蛋白表達Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心肌Ⅲ型膠原陽性表達率（%）分別為12.35±1.87，26.47±4.05，18.01±2.11，13.13±2.51，組間比較差異有統計學意義（n=7，F=16.490，P＜0.05）。與Sham組比較，UCM組Ⅲ型膠原陽性表達率升高（P＜0.05），棕染部分增多；而UCM+H2S組較UCM組Ⅲ型膠原陽性表達率降低（P＜0.05），棕染部分則變少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯棕染，見圖3。

2.5 各組大鼠心肌β-半乳糖苷酶染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組心肌的β-半乳糖苷酶染色陽性率（%）分別為0.67±0.38，27.09±3.44、6.66±2.76和0.44±0.13，組間比較差異有統計學意義（n=7，F=96.710，P＜0.05）。與Sham組相比，UCM組大鼠β-半乳糖苷酶染色陽性率升高（P＜0.05），藍染部分增加；而UCM+H2S組較UCM組β-半乳糖苷酶染色陽性率降低（P＜0.05），藍染部分則變少；Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯藍染，見圖4。

2.6 各組心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達情況與Sham組相比，UCM組大鼠NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53表達增多，SIRT1蛋白表達減少（P＜0.05）；而UCM+H2S組大鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53蛋白表達量較UCM組減少，SIRT1蛋白表達增多（P＜0.05）。與Sham組比較，H2S組大鼠心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P19、P21、P53表達水平差異無統計學意義，見圖5、表3。

3 討論

尿毒癥是各種因素導致腎臟失去正常功能后，機體代謝及生化紊亂的臨床綜合征，其可累及機體多個系統，以心血管系統損害最為突出［10］。近年來，腎臟替代治療的普及雖使尿毒癥患者的存活時間延長［11］，但尿毒癥所致的心肌損害問題也日漸突出。與高血壓、甲狀腺功能亢進等其他因素導致的心肌病變類似，心肌纖維化是UCM發生發展中的重要病理過程，其通常可損害心臟舒張功能并導致心肌重構、誘發心力衰竭，最終嚴重影響尿毒癥患者的生活質量及生存時間。

Fig.2 Masson staining of collagen fibers in myocardial tissue of rats in each group(×400)圖2各組大鼠心肌組織膠原纖維Masson染色（×400）

Fig.3 Expression of typeⅢcollagen in myocardial tissue of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)圖3各組大鼠心肌組織Ⅲ型膠原表達情況（免疫組化染色，×400）

Fig.4 The aging level of myocardial tissue of rats in each group(β-galactosidase staining,×400)圖4各組大鼠左室心肌組織衰老情況（β-半乳糖苷酶染色，×400）

Fig.5 The protein expression levels of SIRT1,P21,P19，P53,NLRP3 and IL-1β in myocardial tissue of rats in each group圖5各組大鼠心肌組織中SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達

Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達水平比較 （n=7，±s）

Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達水平比較 （n=7，±s）

＊P＜0.05；a與Sham組比較，b與UCM組比較，P＜0.05。

組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F SIRT1 0.87±0.07 0.69±0.05a 0.83±0.04b 0.83±0.01 6.381＊P21 0.69±0.02 0.93±0.04a 0.68±0.02b 0.69±0.02 51.420＊P19 1.18±0.08 1.46±0.03a 1.25±0.03b 1.29±0.04 14.150＊組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F P53 0.57±0.01 0.79±0.02a 0.60±0.01b 0.59±0.01 96.370＊NLRP3 0.68±0.03 0.89±0.04a 0.84±0.02b 0.69±0.04 23.890＊IL-1β 0.79±0.07 1.16±0.10a 0.92±0.08b 0.81±0.06 11.980＊

尿毒癥誘發心肌纖維化的機制目前并不清楚，但持續的輕度炎癥和組織器官過早衰老是尿毒癥的特征之一。有研究顯示慢性腎功能衰竭時心肌細胞應激性衰老可誘發心肌纖維化［3］，且其可能與尿毒癥毒素誘發的慢性炎癥反應有關［2］。此外，本課題組近年研究也發現了心肌細胞早衰參與糖尿病心肌纖維化的發生機制［7］。衰老相關蛋白P21、P19及P53是目前被用于評估心肌衰老的重要指標［4，12］。本研究發現，UCM組大鼠存在明顯心肌纖維化，同時炎癥相關蛋白NLRP3、IL-1β及衰老相關蛋白P21、P19及P53在UCM組心肌組織中表達較Sham組顯著增加，通過β-半乳糖苷酶染色法也發現UCM組的心肌衰老較Sham組大鼠更為顯著，以上結果提示炎癥反應及其誘發的心肌細胞過早衰老可能參與了尿毒癥所致的心肌纖維化的發生機制。

沉默信息調節因子（Sirtuins）家族蛋白為一組具有高度保守催化結構域的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰化酶，在細胞衰老、生長發育以及各種疾病過程中均起著關鍵調控作用，同時也是公認的長壽因子。目前發現了哺乳動物體內Sirtuins的7個家族成員，其中在細胞核與細胞質中均有表達的有SIRT1與SIRT2，而主要表達于線粒體的有SIRT3、SIRT4和SIRT5，SIRT6和SIRT7則主要表達于細胞核［13］。其中SIRT1被認為在衰老、細胞凋亡、應激抵抗和炎癥過程中發揮多種功能［14-15］。SIRT1可通過抑制P53的表達活化以及轉化生長因子-β1（TGF-β 1）/Smads信號通路轉導改善肝纖維化［16］。Sun等［17］發現SIRT1可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕阿霉素誘導的心肌重構。此外，有研究發現抑制NLRP3炎癥小體表達可防止心臟衰老［18］。本研究顯示，在UCM組心肌組織中SIRT1蛋白的表達明顯下調，提示SIRT1可能參與了尿毒癥大鼠心肌細胞炎性早衰的調控機制。

H2S是一種新型氣體信號分子，具有抗炎、抗氧化應激等多種生物學保護作用［19］。在心血管系統中其主要有舒張血管平滑肌細胞、促進血管新生以及抑制細胞凋亡等保護作用。同時也有研究顯示，在各種纖維化疾病的動物模型中血清H2S水平下降，而適當補充外源性H2S具有抑制腎、肺、肝、心等組織器官的纖維化的作用［20］。近年也有研究證實H2S能通過減少心肌間質膠原纖維的沉積及Ⅲ型膠原蛋白的表達改善高同型半胱氨酸誘發的大鼠心肌纖維化［21］。本研究發現，相對于UCM組，UCM+H2S組大鼠心肌Masson染色顯示心肌間質膠原纖維沉積減少，且免疫組化染色結果也顯示大鼠心肌中Ⅲ型膠原蛋白表達下降，提示尿毒癥大鼠心肌纖維化得到改善。此外，UCM+H2S組較UCM組大鼠LVFS升高，心功能改善，同時心肌中SIRT1蛋白表達上調，NLRP3炎性小體及炎性因子IL-1β、衰老蛋白P19、P21及P53蛋白表達減少，β-半乳糖苷酶染色陽性率下降，心肌衰老得到緩解。以上提示氣體信號分子H2S可抑制尿毒癥環境下的心肌纖維化，其機制可能與其上調SIRT1蛋白的表達并延緩心肌細胞過早衰老有關。而H2S組和Sham組各指標比較無顯著差異，表明補充該劑量的外源性H2S并不會對正常大鼠造成顯著影響，治療劑量下的H2S是相對安全的。但大劑量的外源性H2S極有可能會對大鼠造成損害甚至死亡［22］，故嚴格把握干預試劑的劑量十分重要。

綜上所述，本研究證實氣體信號分子H2S對尿毒癥心肌病大鼠心肌纖維化的拮抗作用，這可能與SIRT1負性調控尿毒癥環境下心肌炎癥反應、緩解心肌衰老有關。本研究有望為今后UCM的防治提供新的治療靶點及理論依據。