基于荷瘤小鼠模型及生物信息學(xué)探討燥濕解毒復(fù)方對(duì)胰腺癌的影響

王小林 雷洋洋 李建柯 高珊珊 蔡定芳

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科，3中醫(yī)-中西醫(yī)結(jié)合科 上海 200032；2上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032）

胰腺癌起病隱匿，是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，具有“癌癥之王”的稱號(hào)［1］。由于胰腺癌病因復(fù)雜，診斷困難，確診時(shí)只有10%～20%的患者能夠進(jìn)行手術(shù)切除［2］。雖然近年來腫瘤患者的存活率有所提高，但胰腺癌患者的五年生存率仍維持在8%。目前胰腺癌一線治療藥物如吉西他濱常常會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生毒副作用，導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性，而其他治療手段如根治性手術(shù)切除、放化療等效果也不甚理想，因此尋找更有效的治療方法十分重要。前期有研究報(bào)道傳統(tǒng)中藥里含有大量生物活性成分，能夠增強(qiáng)化療藥物的治療效果，減少腫瘤患者治療過程中的不良反應(yīng)，減緩癌痛，從而提高生存質(zhì)量［3-4］。根據(jù)臨床表現(xiàn)，中醫(yī)辯證認(rèn)為胰腺癌核心病機(jī)為濕熱蘊(yùn)毒，主要治療原則為清熱燥濕，解毒抑癌［5］。目前關(guān)于胰腺癌的辯證分型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同的中醫(yī)學(xué)家利用辨證論治的思想以中焦脾虛作為胰腺癌內(nèi)因，以其出現(xiàn)的毒熱、濕阻、痰凝、氣滯、血瘀等表象認(rèn)為胰腺癌的臨床表現(xiàn)與中焦?jié)駸岫拘跋嚓P(guān)，而濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)則是本病首要病機(jī)和發(fā)病的內(nèi)在條件［6］。本研究通過辨證論治以清熱解毒、燥濕消結(jié)、祛邪抑癌原則為主，以清熱解毒、燥濕抑癌中藥組成治療方劑。該治療方劑包括黃連、苦參、山慈菇、青黛、姜黃、牛黃及雄黃。本實(shí)驗(yàn)擬觀察燥濕解毒復(fù)方對(duì)小鼠胰腺癌細(xì)胞株皮下荷瘤生長(zhǎng)的影響，并利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫推斷該燥濕解毒復(fù)方針對(duì)胰腺癌的潛在治療靶點(diǎn)及相關(guān)生物學(xué)通路，為中醫(yī)藥治療胰腺癌提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

瘤株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠源胰腺癌Panc02細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胰腺外科惠贈(zèng)。6～7周齡C57BL/6雄性小鼠共40只，購自上海杰司捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)為20180004024014）。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2020-069）。小鼠由普通飼料喂養(yǎng)，保證自由進(jìn)食，水源充足，光照時(shí)間為12 h，飼養(yǎng)溫度為18～28℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度達(dá)40%～70%。

主要試劑與耗材RPMI-1640，胎牛血清，0.25% Trypsin-EDTA，無菌磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，Gibco，pH 7.4），均購自美國(guó)Gibco公司；T25、T75透氣培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司）；游標(biāo)卡尺（得力集團(tuán)有限公司）。

小鼠胰腺癌細(xì)胞株皮下荷瘤模型的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Panc02細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基后使用無菌PBS清洗，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞。待顯微鏡下觀察到細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙后，使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化后離心（r=17.9 cm，1 000 r/min，5 min）。棄去上清液，用無菌PBS清洗一遍，最后用PBS重懸后將細(xì)胞置于冰上備用。使用1 mL微量注射器吸取細(xì)胞懸液0.1 mL（2×106個(gè)細(xì)胞）并緩慢注入小鼠背部皮下，注射后局部穿刺點(diǎn)按壓1 min后觀察有無滲漏。以上所有實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵照無菌要求。每日檢查小鼠的一般狀況，觀察及觸診腫瘤的生長(zhǎng)狀況并做好瘤體質(zhì)量的測(cè)量及記錄。

中藥復(fù)方湯劑制備中藥組合方劑包括黃連30 g，苦參20 g，山慈菇20 g，青黛10 g，姜黃20 g，牛黃5 g以及雄黃2 g，此治療方劑以70 kg/d人體劑量為標(biāo)準(zhǔn)配置。將黃連30 g、苦參20 g、山慈菇20 g、姜黃20 g研磨成粉末后裝入煎藥包中，放入陶瓷砂鍋中浸泡10 min使藥物完全被水滲透以便于有效成分的溶解。頭煎時(shí)加入700 mL純凈水煎熬30 min，兩煎時(shí)加入800 mL純凈水煎熬50 min以便使藥物之間充分作用，同時(shí)使藥物中的有效成分能夠徹底溶出從而增強(qiáng)療效。然后用文火煎熬濃縮至100 mL后冷卻并使用無菌紗布過濾藥液，最后加入青黛10 g、牛黃5 g和雄黃2 g充分?jǐn)嚢杌靹蚝蠓盅b至50 mL離心管（濃度：1.07 g/mL），置于4℃冰箱保存。

胰腺癌皮下成瘤小鼠分組與給藥C57BL/6雄性小鼠荷瘤7天后，根據(jù)人和小鼠體表面積等效劑量比值計(jì)算公式［7］，將小鼠隨機(jī)分為4組，分別為高劑量給藥組［27.82 g生藥/（kg·d）］，中等劑量給藥組［13.91 g生藥/（kg·d）］，低劑量給藥組［6.96 g生藥/（kg·d）］以及PBS對(duì)照組，每組10只。每日上午定時(shí)灌胃給藥1次，共21天。

觀察項(xiàng)目及計(jì)算方法每日灌藥前稱量并記錄小鼠體質(zhì)量。測(cè)量荷瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照腫瘤體積計(jì)算公式V=（a×b2）/2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線［8］。給藥21天后處死小鼠取出腫瘤組織進(jìn)行稱量，并按以下公式計(jì)算腫瘤抑制率：腫瘤抑制率%=（對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。當(dāng)腫瘤抑制率＞30%，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有明顯差異者（P＜0.05）認(rèn)為有抗腫瘤作用［9］。

燥濕解毒復(fù)方活性成分與胰腺癌潛在靶點(diǎn)篩選利用基于研究中藥分子機(jī)制的在線生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine）（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）篩選復(fù)方針對(duì)胰腺癌的潛在靶點(diǎn)，探索中藥-靶向途徑/疾病關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和生物途徑與突出的中藥相關(guān)性靶標(biāo)，探索配方分子生物學(xué)水平的治療機(jī)制［10］。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及基因本體論富集分析借助STRING（https://string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）分 析［11］。篩選條件為（1）Protein Name：靶點(diǎn)蛋白；（2）Organism：Homo sapiens。每個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node）代表不同的靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊（Edge）代表各靶點(diǎn)之間存在相互作用。根據(jù)程度值（Degree）由大到小的順序進(jìn)行靶點(diǎn)基因的基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析。GO富集結(jié)果主要包括生物過程（biological process，BP），根據(jù)P值篩選出排名前十的生物學(xué)過程。

靶點(diǎn)基因在胰腺癌中的表達(dá)及對(duì)患者總生存期的影響借助GEPIA 2（http://gepia2.cancerpku.cn/）數(shù)據(jù)庫分析該復(fù)方中藥內(nèi)靶點(diǎn)基因在胰腺癌和癌旁組織中的差異表達(dá)［12］。設(shè)定的篩選條件為：（1）Gene：靶點(diǎn)基因；（2）Cancer name：PAAD（pancreatic adenocarcinoma）；（3）|Log2FC|Cutoff：1；P-value Cutoff：0.01。選擇log2（TPM+1）作為柱狀圖縱坐標(biāo)。進(jìn)一步借助GEPIA 2分析靶點(diǎn)基因與胰腺癌患者總生存期之間的關(guān)系，設(shè)定的條件參數(shù) 為：（1）Gene：靶 點(diǎn) 基 因；（2）Methods：Overall Survival；（3）Group Cutoff：Median；Cutoff-High（%）：50；Cutoff-Low（%）：50；（4）Hazards Ratio：Yes；（5）Axis Units：Months.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，各組間差異檢驗(yàn)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。靶點(diǎn)基因在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)，靶點(diǎn)基因與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行分析并采用Log-Rank進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同劑量治療方劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)曲線的影響實(shí)驗(yàn)過程中荷瘤小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及精神狀態(tài)良好，進(jìn)食飲水正常。從給藥第8天開始，各組小鼠腫瘤體積開始出現(xiàn)差異，中等劑量給藥組以及高劑量給藥組小鼠腫瘤體積生長(zhǎng)曲線平穩(wěn)但未停滯。低劑量給藥組和對(duì)照組小鼠腫瘤體積生長(zhǎng)曲線陡直，生長(zhǎng)速度較快并且生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致（圖1）。

不同濃度治療方劑對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量以及抑瘤作用的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，給藥前和給藥21天后4組小鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在給藥過程中，高劑量給藥組中部分小鼠在給藥早期出現(xiàn)體質(zhì)量下降，在給藥中后期時(shí)體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，推測(cè)可能與該方劑中雄黃等成分的毒副作用相關(guān)，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。抑瘤結(jié)果提示該治療方劑的抗腫瘤作用具有明顯的藥物濃度依賴性，與對(duì)照組和低劑量組相比，高劑量組［27.82 g生藥/（kg·d）］與中等劑量組［13.91生藥/（kg·d）］的抗腫瘤作用較為明顯，其抑瘤率分別為50.00%和43.75%（表1）。

表1 各組小鼠抑瘤率比較Tab 1 Comparison of tumor inhibition rate in each mice group （±s）

表1 各組小鼠抑瘤率比較Tab 1 Comparison of tumor inhibition rate in each mice group （±s）

Group After experimnt t P High-dose Medium-dose Low-dose Control Dosage［g crude drug/（kg·d）］27.82 13.91 6.96-The number of mice（n）Before experiment 10 10 10 10 6 8 8 8 The weight of mice（g）Before experiment 25.04±1.19 24.74±1.33 25.56±1.28 25.75±2.18 After experimnt 24.88±1.85 24.38±1.14 25.49±1.51 26.15±3.80 Tumor weight（g）0.16±0.08 0.18±0.06 0.23±0.04 0.32±0.08 Tumor inhibition rate（%）50.00 43.75 28.12--3.875-3.941-3.142 0.002 0.002 0.007

該燥濕解毒復(fù)方治療胰腺癌的潛在靶點(diǎn)利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫共檢索出該燥濕解毒復(fù)方在胰腺癌治療中的8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，分別是APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS。其中山慈菇在胰腺癌中的潛在靶點(diǎn) 為APP、PLK1、PPARG，青 黛 的 潛 在 靶 點(diǎn) 為CA2、EGFR，姜 黃 的 潛 在 靶 點(diǎn) 為CA2、PPARG、RARB，牛黃的潛在靶點(diǎn)為EGFR、PPARG，黃連的潛在靶點(diǎn)為EGFR，苦參的潛在靶點(diǎn)為CA2、EGFR、NTSR1、RARB、TYMS，雄黃的潛在靶點(diǎn)為TYMS。

PPI網(wǎng)絡(luò)及基因功能富集分析利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)以上靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（圖2）。GO分析顯示該燥濕解毒復(fù)方治療胰腺癌的潛在靶點(diǎn)在生物過程方面主要涉及調(diào)節(jié)骨吸收、細(xì)胞對(duì)維生素A的反應(yīng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、對(duì)超氧陰離子的正向調(diào)節(jié)、蘇氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)、肝細(xì)胞再生、一碳代謝過程、RNA聚合酶Ⅱ?qū)ri-miRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和柱狀上皮細(xì)胞的發(fā)育等（表2）。

表2 基于STRING數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)蛋白GO分析Tab 2 The GO analyses of target proteins based on the STRING database

圖2 基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Protein-protein interactions（PPI）of target proteins were constructed based on the STRING database

靶點(diǎn)基因在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達(dá)差異GEPIA 2數(shù)據(jù)庫包含179例胰腺癌組織和171例正常胰腺組織。數(shù)據(jù)分析顯示APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS在胰腺癌組織中均呈顯著高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，P＜0.05）。

圖3 靶點(diǎn)基因在胰腺癌與正常胰腺組織中的表達(dá)Fig 3 The expression level of target genes in pancreatic cancer tissues in comparison to those in normal tissues

靶點(diǎn)基因表達(dá)對(duì)胰腺癌患者總生存率的影響為進(jìn)一步研究靶點(diǎn)基因表達(dá)水平與胰腺癌患者生存期的關(guān)系，我們利用GEPIA 2數(shù)據(jù)庫生存分析功能發(fā)現(xiàn)EGFR和PLK1高表達(dá)組的患者生存率降低（圖4，P＜0.05），提示EGFR和PLK1與胰腺癌患者預(yù)后存在相關(guān)性。

圖4 靶點(diǎn)基因表達(dá)水平與胰腺癌患者總生存率的關(guān)系Fig 4 The relationships between the target genes expressions and overall survival（OS）in patients with pancreatic cancer

討 論

胰腺癌發(fā)病率逐年升高，預(yù)計(jì)到2030年將成為全球第二大致死癌癥。由于其發(fā)展快、病程短、易轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者初診時(shí)即伴有遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移從而喪失了最佳治療時(shí)機(jī)［13-14］。在中醫(yī)里，胰腺癌屬“癥瘕”“膵癥”范疇，其核心病機(jī)為“濕熱蘊(yùn)毒”。該燥濕解毒復(fù)方針對(duì)胰腺癌核心病機(jī)以苦參、黃連、山慈菇、青黛、姜黃、牛黃、雄黃組成。方中苦參、黃連燥濕清熱為君，牛黃、雄黃解毒清熱為臣，山慈菇、青黛佐君藥解毒，姜黃使臣藥破瘀。中醫(yī)藥物學(xué)經(jīng)典著作《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：苦參味苦寒，主心腹結(jié)氣，癥瘕積聚，黃疸。黃連味苦寒，主熱氣。雄黃味苦平寒，主寒熱，鼠瘺惡創(chuàng)，疽痔死肌。牛黃味苦平，主驚癇，寒熱，熱盛狂痓。李時(shí)珍《本草綱目》記載：姜黃辛苦大寒，無毒，主治癥瘕血塊，心腹結(jié)積。《要藥分劑》曰：青黛除熱解毒，兼能涼血?！吨兴幋筠o典》謂山慈菇消腫散結(jié)，化痰解毒。現(xiàn)代研究表明用中醫(yī)治療胰腺癌能有效改善晚期胰腺癌患者的生存質(zhì)量，提高患者的帶瘤生存期［15］。例如清胰化積方能夠顯著提高晚期胰腺癌患者的五年生存率以及中位生存期［16］，為胰腺癌從濕熱解毒論治提供了更多科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：與對(duì)照組比較，高劑量以及中等劑量的燥濕解毒復(fù)方均能夠有效抑制胰腺癌細(xì)胞皮下荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率分別為50.00%和43.75%，抑瘤率呈劑量依賴關(guān)系。借助BATMAN-TCM在線數(shù)據(jù)庫我們推測(cè)出該燥濕解毒復(fù)方治療胰腺癌的潛在靶點(diǎn)蛋白包括APP、PLK1、PPARG、CA2、EGFR、RARB、NTSR1、TYMS。GO分析結(jié)果推測(cè)這些靶點(diǎn)在人體內(nèi)參與的生物學(xué)過程可能包括調(diào)節(jié)骨吸收、細(xì)胞對(duì)維生素A的反應(yīng)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、對(duì)超氧陰離子的正向調(diào)節(jié)、蘇氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)、肝細(xì)胞再生、一碳單位的代謝過程、RNA聚合酶Ⅱ?qū)ri-miRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、柱狀上皮細(xì)胞的發(fā)育等。以上大部分生物學(xué)過程在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程中都發(fā)揮重要作用［17-19］，靶向抑制這些生物學(xué)過程在癌癥治療中具有重要臨床意義。

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)基因在胰腺癌組織中的表達(dá)均顯著上調(diào)，對(duì)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)在胰腺癌患者中EGFR和PLK1高表達(dá)提示預(yù)后不良。EGFR已被證實(shí)與實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)、分化與增殖相關(guān)。在胰腺癌患者中，EGFR與胰腺癌患者的分期、轉(zhuǎn)移以及分化相關(guān)［20］。PLK1是一種能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，抑制PLK1的表達(dá)能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［21］。由于EGFR和PLK1與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，針對(duì)EGFR和PLK1的靶向治療將為胰腺癌患者的早期診斷、預(yù)后及治療提供極大的幫助。

本研究基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及生物信息學(xué)結(jié)果推測(cè)該燥濕解毒復(fù)方在胰腺癌治療方面具有較好的臨床應(yīng)用前景，但其確切作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

作者貢獻(xiàn)聲明王小林論文構(gòu)思、撰寫和修訂。雷洋洋論文撰寫，實(shí)驗(yàn)操作，數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析。李建柯，高珊珊論文修訂，實(shí)驗(yàn)操作，數(shù)據(jù)采集。蔡定芳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。