組織激肽釋放酶12對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

胡丕波 劉蒙蒙 陳炯

1湖州市中心醫院普外科，湖州 313000；2湖州市中心醫院病理科，湖州 313000；3中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)普外科，合肥 230001

胰腺癌起病隱匿，進展迅速，被確診后往往處于晚期階段[1]。手術根治性切除仍然是目前胰腺癌最優先采用的治療方式，但只有10%～20%的患者有根治性手術的機會，且5年生存率也僅為15%～25%[2]，因此尋找胰腺癌的生物標志物來提高其早期診斷率尤為重要。組織激肽釋放酶(kallikrein related peptidase, KLKs)屬于蛋白水解酶的絲氨酸蛋白酶家族，共有15個成員(KLK1～KLK15)，在多種腫瘤的發展進程中起作用，被認為是潛在的腫瘤標志物[3]。KLK12作為KLKs成員之一，在人體的多種腫瘤中異常表達，且與腫瘤的進展有關[4-5]，但關于其在胰腺癌中的表達及作用少有報道。本研究檢測KLKL12在胰腺癌組織及胰腺癌細胞株中的表達，探討其作用機制及臨床意義。

材料與方法

一、臨床標本和胰腺癌細胞株

收集2014年2月至2018年10月間中國科學技術大學附屬第一醫院膽胰外科行根治性手術切除且病理確診的95例胰腺癌患者的癌組織和匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術切緣>3 cm)。其中男性58例，女性37例，年齡43～78(60±11)歲，≤60歲者36例，>60歲者 59 例；腫瘤位于胰頭部51例，胰體尾部44例；腫瘤高分化54例，中、低分化41例；參照第八版AJCC分期標準，Ⅰ+Ⅱ期73例，Ⅲ+Ⅳ期22例；神經浸潤 50 例，淋巴結轉移70例。所有患者術前均未接受放療、化療及免疫治療。

正常胰腺腺泡細胞株HPDE6-C7和胰腺癌細胞株SW1990、PANC1購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。常規復蘇、培養及傳代。

二、方法

1.KLK12蛋白表達檢測：取石蠟包埋的胰腺癌組織及相應的癌旁組織，常規脫蠟及抗原修復后，采用EnVision 法檢測組織的KLK12蛋白表達。兔抗人KLK12一抗購自R&D system公司，工作濃度1∶200；山羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹生物公司，工作濃度1∶5 000；顯色底物DAB購自北京中杉金橋公司。采用半定量法評分，陽性細胞數占總細胞數的0～10%計0分，11%～50%計2分，>50%計3分；細胞胞質未著色計0分，呈淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。兩項分數乘積≤3分為低表達，>3分為高表達[6]。所有切片均由兩名經驗豐富的病理科醫師獨立評分，再共同協商一致。

分別收集對數生長期HPDE6-C7、SW1990和PANC1細胞，離心后加細胞裂解液置冰上充分裂解，離心取上清，加上樣緩沖液，采用蛋白質免疫印跡法檢測細胞KLK12蛋白表達，以β-actin為內參對照。抗KLK12一抗購自R&D system公司，工作濃度1∶500；辣根過氧化物酶標記的IgG購自武漢三鷹生物公司，工作濃度1∶10 000。ECL(美國Thermo公司)發光，X片曝光、顯影、定影，Image J軟件掃描條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示目的蛋白表達量。

2.KLK12 mRNA表達檢測：分別提取3株胰腺癌細胞總RNA，使用RNA逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)將其逆轉錄為cDNA，然后以cDNA作為模板進行擴增反應，采用熒光定量PCR法檢測KLK12 mRNA的表達。KLK12正向引物序列為5′-GCCTCAACCTCTCCATCGTC-3′，反向引物序列為5′-CTTGAAGGACTCCCCCACAC-3′。以β-actin為內參，其正向引物序列為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，反向引物序列為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。95℃ 3 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，通過公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

3.KLK12基因表達抑制及過表達的胰腺癌細胞株構建：攜帶靶向KLK12基因的siRNA質粒(siRNA-KLK12)及KLK12過表達質粒(KLK12-OE)由武漢淼靈生物公司制備。采用脂質體轉染法將質粒轉染到對數生長期的胰腺癌細胞，以未轉染的胰腺癌細胞作為空白對照組(NC)，以轉染攜帶相應陰性對照質粒siRNA-NC、OE-NC的胰腺癌細胞作為陰性對照組。過表達載體質粒選用pCMV-3×FLAG，LipofectamineTM2000試劑盒購自賽默飛公司，按說明書操作。引物序列(5′-3′)：siRNA-KLK12上游為AAACAGUGACAGCCACGUATT，下游為UACGUGGCUGUCACUGUUUGG；siRNA-NC上游為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，下游為ACGUGACAAGAATT；KLK12-OE上游為TGGCAGACAAAGAGACAAGAC，下游為GTTGAACGCTGCTGGTTACG；OE-NC上游為GCAAATGGGCGGTAGGCGTG，下游為TCGTTGGGCGGTCAGC。

4.細胞增殖實驗：收集轉染24～48 h的上述各組細胞，培養液重懸，調整細胞密度為2×104/ml，96孔板每孔加入100 μl細胞懸液，常規培養12、24、36、48、60、72 h，每組設置3個復孔。培養到時間點后每孔加入10 μl CCK8，繼續培養4 h，上酶標儀測450 nm處的吸光值(A450值)。CCK8試劑盒購自上海貝博公司，按說明書操作。

5.細胞侵襲、遷移實驗：分別收集并重懸轉染后的各組細胞(5×105/ml))。Transwell小室上層加入200 μl細胞懸液，下層加入培養基，常規培養48 h，取出小室隔膜，用棉棒輕輕擦去隔膜上表面未穿膜細胞，甲醛固定隔膜20 min，結晶紫染色15 min，清洗后烘干，置顯微鏡下隨機選擇5個視野，計算穿膜細胞數，取均值。隔膜鋪基質膠的小室做侵襲實驗，隔膜未鋪基質膠的小室做遷移實驗，每個實驗重復3次，取均值。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌組織KLK12蛋白陽性表達率及其與臨床病理特征的關系

KLK12蛋白主要定位于胞質，呈現棕黃色顆粒。95例胰腺癌組織中67例陽性，陽性率為70.5%；匹配的癌旁組織中28例陽性，陽性率為29.5%，胰腺癌組織KLK12陽性率顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=23.01，P<0.001)。

胰腺癌組織KLK12的蛋白表達與腫瘤分化程度低(P=0.007)、TNM分期晚(P=0.001)和淋巴結轉移(P=0.018)呈顯著相關，而與年齡、性別、腫瘤位置、神經浸潤等無相關性(表1)。

表1 胰腺癌組織KLK12表達與臨床病理參數的相關性(例)

二、HPDE6-C7、SW1990、PANC1細胞KLKL12蛋白及mRNA表達量

HPDE6-C7、SW1990及PANC1細胞KLK12蛋白表達量分別為0.21±0.01、0.34±0.01、0.28±0.01(圖1)，KLKL12 mRNA表達量分別為1.41±0.20、3.31±0.10、2.91±0.09，SW1990及PANC1細胞的表達量均顯著高于HPDE6-C7細胞，差異均有統計學意義(P值均<0.01)。故后續實驗只采用SW1990、PANC1細胞。

圖1 HPDE6-C7(1)、SW1990(2)、PANC1(3)細胞的KLKL12蛋白表達

三、轉染后SW1990、PANC1細胞KLKL12蛋白表達量的變化

SW1990細胞的NC組、siRNA-NC組、siRNA-KLK12組KLK12蛋白的表達量分別為1.00±0.02、0.98±0.04、0.51±0.04，PANC1細胞3組KLK12蛋白表達量分別為0.65±0.03、0.62±0.04、0.38±0.03。siRNA-KLK12組細胞KLK12蛋白表達量均顯著低于NC組和siRNA-NC組(P值均<0.05，圖2)，表明抑制KLK12表達的細胞株構建成功。

圖2 SW1990(2A)、PANC1(2B)的空白對照組(1)、siRNA-NC組(2)、siRNA-KLK12組(3)細胞的KLK12蛋白表達 圖3 SW1990(3A)、PANC1(3B)的空白對照組(1)、OE-NC組(2)、KLK12-OE組(3)細胞的KLK12蛋白表達

SW1990細胞的NC組、OE-NC組、KLK12-OE組KLK12蛋白表達量分別為0.81±0.01、0.84±0.02、1.08±0.02，PANC1細胞3組KLK12蛋白表達量分別為0.75±0.02、0.81±0.02、1.11±0.03，KLK12-OE組細胞KLK12蛋白表達量均顯著高于NC組和OE-NC組(P值均<0.05，圖3)，表明KLK12過表達細胞株構建成功。

四、轉染后SW1990、PANC1細胞增殖能力的變化

培養72 h，SW1990、PANC1細胞的siRNA-KLK12組A450值分別為0.94±0.02、0.96±0.03，NC組分別為1.12±0.03、1.15±0.03，siRNA-NC組分別為1.16±0.05、1.21±0.03，siRNA-KLK12組A450值均小于NC組和siRNA-NC組(P值均<0.05，圖4)，表明抑制KLK12表達能有效抑制胰腺癌細胞的增殖能力。

圖4 SW1990(4A)、PANC1(4B)的空白對照組、siRNA-NC組、siRNA-KLK12組細胞的生長曲線 圖5 SW1990(5A)、PANC1(5B)的空白對照組、OE-NC組、KLK12-OE組細胞的生長曲線

培養72 h，SW1990、PANC1細胞的KLK12-OE組A450值分別為1.32±0.03、1.26±0.04，NC組分別為1.06±0.02、1.05±0.03，OE-NC組分別為1.11±0.03、1.08±0.03，KLK12-OE組A450值均顯著大于NC組和OE-NC組(P值均<0.01，圖5)，表明KLK12過表達能明顯增強胰腺癌細胞的增殖能力。

五、轉染后SW1990、PANC1細胞的侵襲、遷移能力變化

SW1990、PANC1的siRNA-KLK12組的穿膜細胞數分別為(373.7±14.8)、(556.3±13.6)個/高倍視野，NC組分別為(741.7±11.6)、(668.3±16.5)個，siRNA-NC組分別為(726.0±11.8)、(646.0±15.1)個/高倍視野(圖6)；siRNA-KLK12組的遷移細胞數分別為696.0±13.1、449.0±16.5個/高倍視野，NC組分別為854.3±21.5、610.3±11.9個/高倍視野；siRNA-NC組分別為841.3±15.4、595.7±8.6個/高倍視野(圖7)。siRNA-KLK12組穿膜細胞數和遷移細胞數均較NC組和siRNA-NC組顯著減少(P值均<0.05)，表明抑制KLK12表達可明顯降低細胞的侵襲和遷移能力。

圖6 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對照組(上)、siRNA-NC組(中)、siRNA-KLK12組(下)穿膜細胞(結晶紫染色 ×200)

圖7 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對照組(上)、siRNA-NC組(中)、siRNA-KLK12組(下)的遷移細胞(結晶紫染色 ×200)

SW1990、PANC1的KLK12-OE組的穿膜細胞數分別為556.3±22.2、571.0±17.4個/高倍視野；NC組分別為393.0±15.5、354.3±14.9個/高倍視野，OE-NC組分別為402.7±10.5、426.7±23.3個/高倍視野(圖8)；KLK12-OE組遷移細胞數分別為639.3±16.5、740.3±13.0個/高倍視野，NC組分別為451.3±11.6、468.0±8.7個/高倍視野，OE-NC組分別為433.0±11.8、442.7±10.3個/高倍視野(圖9)。KLK12-OE組穿膜細胞數和遷移細胞數均較NC組和OE-NC組顯著增加(P值均<0.05)，表明KLK12過表達可明顯增強細胞的侵襲和遷移能力。

圖8 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對照組(上)、OE-NC組(中)、KLK12-OE組(下)的穿膜細胞(結晶紫染色 ×200)

圖9 SW1990(左)、PANC1(右)的空白對照組(上)、OE-NC組(中)、KLK12-OE組(下)的遷移細胞(結晶紫染色 ×200)

討 論

KLK家族在細胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及消化系統酶活化等多種生理過程中起作用。KLK以組織特異性的方式表達，并分別受類固醇激素和絲氨酸蛋白酶抑制劑等轉錄和轉錄后機制調控[7]。KLK3又稱前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)，目前已被臨床常規用于前列腺癌的篩查[8]。KLK6可以通過切割纖維蛋白原、膠原蛋白和層黏連蛋白參與腫瘤的血管生成和轉移[9]。而本課題組所研究的KLK12也已經被發現與多種腫瘤的發生和發展有關。Li等[10]研究發現KLK12在結腸癌中呈高表達，進一步利用基因沉默技術敲低結腸癌HT-29細胞中KLK12的表達后發現，腫瘤細胞的活力及侵襲力明顯下降，且這一效應可能是借助AMPK/mTOR信號通路來實現的。同樣在結腸癌中，Xia等[11]采用新型的硒納米顆粒技術下調了結腸癌細胞中KLK12的表達，通過體內及體外實驗發現腫瘤細胞的生長被顯著抑制。Li等[12]發現KLK12在AGS胃癌細胞中的表達強于GES-1胃正常細胞，利用siRNA轉染技術后發現AGS細胞的增殖及遷移能力顯著被抑制，并使其細胞周期停滯在G0/G1期。Gong等[13]通過實時熒光定量PCR檢測116例三陰性乳腺癌組織中KLK12 mRNA的表達，其中54例(47%)陽性表達，并通過隨訪及生存分析發現KLK12mRNA的陽性表達與患者不良預后顯著相關。

本研究結果顯示KLK12蛋白和mRNA在胰腺癌細胞株SW1990、PANC1的表達均明顯高于正常胰腺細胞株HPDE6-C7，下調KLK12表達后，胰腺癌細胞增殖、侵襲以及遷移能力明顯下降，而上調其表達后上述能力又明顯增強。胰腺癌組織KLK12蛋白陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，且KLK12高表達與腫瘤分化程度、TNM分期以及淋巴結轉移存在正相關，提示KLK12促進胰腺癌的發生與發展。

綜上所述，KLK12可以促進胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為，提示其可能成為新的潛在的生物學標志物。關于KLK12在胰腺癌中的作用機制以及其是否會成為新的治療靶點仍需要更多研究進一步深入。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明胡丕波：研究操作、數據整理、論文撰寫；劉蒙蒙：數據整理、統計分析；陳炯：研究設計、研究指導、論文修改