電針耳迷走神經對斷奶前母本隔離模型小鼠焦慮、抑郁樣行為的影響

吳 楠，王 強，2，3，李永豐，2，3，吳宇蔚，2，3，喬海法，2，3，李國徽，4*，袁 偉，2，3*

1 陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046；

2 陜西省針藥結合重點實驗室，陜西 咸陽 712046；

3 咸陽市神經生物學（針灸）重點實驗室，陜西 咸陽 712046；

4 寧夏醫科大學附屬銀川市中醫醫院，寧夏 銀川 750010

抑郁癥是以持續的情緒低落、興趣減退、失眠等為主要臨床表現的疾病［1］。世界衛生組織調查數據顯示，近年來抑郁癥的患病率呈上升趨勢，抑郁癥已經成為危害人類健康的主要疾病之一［2］。有研究發現，抑郁癥在發病年齡上呈現出年輕化趨勢，青少年抑郁癥的患病率為5%～8%［3］，成為威脅青少年身心健康的主要疾病之一，其高患病率給患者及其家庭、社會都帶來了巨大的影響。由于兒童或青少年正處于生長發育的特殊階段，傳統單胺神經遞質類藥物以及選擇性5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）再攝取抑制劑類藥物的療效欠佳且具有一定的局限性。研究顯示，電針治療抑郁癥具有良好療效［4］，且具有安全、經濟、毒副作用小等優勢，在情志類疾病的治療中應用較為廣泛。迷走神經耳支主要分布于耳甲區，治療抑郁癥時常將其作為針刺部位［5］，但其具體作用機制尚不完全清楚。

有研究表明，5-HT和抑郁癥關系密切［6］，而色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）是合成神經遞質5-HT過程中重要的酶，其中TPH2主要表達于腦干中縫神經元和腸道肌腸層神經元，是5-HT神經元的特異性標志物之一。中縫背核（dorsal raphe nucleus，DRN）中有大量5-HT神經元的表達［7］，其活性水平降低會影響5-HT系統的穩定性，導致個體情緒的異常［8］。此外，壓力能顯著影響前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）的神經元活性，特別是早期生活壓力能顯著影響個體的行為及神經發育，嚴重影響其情緒，甚至可能誘發抑郁癥［9-10］。但是，電針耳迷走神經是否能改變DRN、PFC的腦區活性和DRN腦區的5-HT神經元數量，從而緩解焦慮、抑郁樣行為尚不清楚。本研究采取斷奶前母本隔離（preweaning maternal separation，PMS）C57BL/6小鼠模型模擬兒童抑郁癥，觀察電針耳迷走神經對PMS誘發的焦慮、抑郁樣行為的影響及其可能的作用機制，為電針耳迷走神經治療青少年抑郁癥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用SPF級C57BL/6小鼠的繁殖子代鼠，繁殖鼠購自西安交通大學醫學院動物中心，鼠齡7～8周，體質量（20±2）g，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2018-001。飼養環境均為恒定濕度（50±10）%，恒定溫度（22±2） ℃，12 h晝夜交替照明（光照時間8：00—20：00），自由獲取食物和水。實驗過程嚴格按照科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》《陜西省實驗動物管理辦法》執行。

1.2 主要試劑與設備

原癌基因蛋白（c-fos）抗體（美國Cell Signaling Technology公 司，生 產批 號：2250S）；TPH2抗 體（美國Cell Signaling Technology公司，生產批號：33113ES60）；Alexa Fluor 647山羊抗兔熒光二抗（上海翊圣生物科技有限公司，生產批號：33113ES60）；多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，生產批號：30625-89）；曠場實驗箱、高架十字迷宮、懸尾測試箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；行為學記錄分析系統（荷蘭Noldus公司，型號：EthoVision）；韓氏電針儀（南京濟生醫療科技有限公司，型號：HANS-200A）；冰凍切片機（美國Thermo Scientific公司，型號：HM525NX）；熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號：

S220）。

1.3 實驗動物分組和模型制備

將3只成年C57BL/6雄鼠與9只成年C57BL/6雌鼠隨機合籠（雄雌比1∶3），待雌鼠受孕后采用隨機數字表法分為對照組和母本隔離組，對照組常規飼養，正常提供食物和飲水。母本隔離組在造模完成后，其子代采用隨機數字表法分為模型組和電針組，每組10只。母本隔離組的母鼠生產后，母本正常照顧至出生第13天，從第14天開始每天將母鼠移出居住籠4 h，留幼仔單獨居住，4 h后將母鼠移回居住籠，直至21 d斷奶，通過曠場、高架十字迷宮測試來確定母本隔離模型制備是否成功［11］。

1.4 干預方法

模型建立后，電針組在異氟烷麻醉下進行電針干預。采用0.25 mm×13 mm不銹鋼針灸針進行針刺，平刺2 mm，針刺穴位參照《常用實驗動物針灸穴位圖譜及穴位》取雙側耳甲區，電針過程采用連續波，頻率2 Hz，強度1 mA，1次/d，10 min/次，6 d/療程，共干預2個療程。對照組、模型組參照電針組進行麻醉束縛，但不進行電針干預。

1.5 觀察指標

1.5.1行為學檢測 干預完成后采用曠場測試、高架十字迷宮測試、懸尾測試等方法對各組小鼠進行行為學測試。

1.5.1.1曠場測試 在曠場測試前2 h將小鼠放在行為測試房中適應環境，此后，將小鼠置于曠場實驗箱（40 cm×40 cm×40 cm）中進行曠場測試。小鼠頭部固定朝向同1個方向，自由活動10 min并記錄小鼠總移動距離及中心區域時間百分比。

1.5.1.2高架十字迷宮測試 在高架十字迷宮測試前2 h將小鼠放在行為測試房中適應環境，此后，將小鼠置于高架十字迷宮［2條開臂（30 cm×8 cm）、2條閉臂（30 cm×6 cm×15 cm）、中心區域（8 cm×8 cm）、距地面高度55 cm］中進行高架十字迷宮測試。小鼠頭部正對一側開臂方向，自由活動10 min，記錄小鼠在開臂花費時間、開臂總移動距離及進入開臂次數。

1.5.1.3懸尾測試 在懸尾測試前2 h將小鼠放在行為測試房中適應環境，此后，將小鼠置于懸尾實驗箱（30 cm×30 cm×50 cm）進行懸尾測試。將醫用膠帶粘貼在距離小鼠尾尖1 cm處并將小鼠懸掛在懸尾支架上，使小鼠鼻尖與設備臺面距離約35 cm。使用攝像機記錄小鼠6 min活動情況，對每只小鼠的活動時間進行統計分析。

每只小鼠完成以上3項測試后，均噴灑30%酒精去除小鼠在活動箱遺留的氣味，防止對下1只小鼠實驗結果造成干擾。

1.5.2腦組織c-fos及5-HT表達水平檢測 在行為學測試結束后，將小鼠單獨置于安靜環境90 min后取材。通過腹腔注射過量烏來糖致小鼠安樂死，使用0.9% NaCl溶液對小鼠心臟進行灌注，灌注至肝臟和四肢發白，右心耳無血液流出，將輸液管與4%多聚甲醛溶液連接。灌注完成后迅速將腦組織取出，置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h。將固定好的腦組織取出依次放入20%、30%蔗糖溶液中脫水，隨后將腦組織放入包埋盒中，滴入包埋劑用冰凍切片機連續切片（40 μm），收集 PFC、DRN腦區備用。切片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，每次10 min。使用含3‰ triton X-100的山羊血清封閉1 h，滴加c-fos（1∶1 000）和TPH2（1∶1 000）一抗4 ℃冰箱孵育過夜，孵育完成后使用PBS溶液洗3次，10 min/次，滴加Alexa Fluor 647熒光二抗（1∶400）室溫孵育2 h，孵育完畢后使用PBS洗3次，10 min/次。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）中孵育10 min，使用抗熒光淬滅封片劑封片，用熒光顯微鏡觀察PFC、DRN腦區c-fos和DRN腦區5-HT的表達，并在相應腦區選擇相同位置的典型區域（200 μm×200 μm）進行細胞數量統計。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布者，數據以（xˉ±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Turky法。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組小鼠行為學指標比較

2.1.13組曠場實驗行為比較 3組總移動距離和中心區域時間百分比比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，模型組總移動距離和中心區域時間百分比均明顯降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組總移動距離和中心區域時間百分比均明顯更高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖 1 3組小鼠曠場活動軌跡圖Figure 1 Representative tracing of movement in the open field in three groups

表1 3組曠場測試檢測指標比較（xˉ±s）Table 1 Comparison of detection indicators in open field in three groups （xˉ±s）

2.1.23組高架十字迷宮行為比較 3組開臂花費時間、開臂總移動距離及進入開臂次數比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，模型組開臂花費時間、開臂總移動距離及進入開臂次數均明顯降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組開臂花費時間、開臂總移動距離及進入開臂次數均明顯更高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 3組高架測試檢測指標比較（xˉ±s）Table 2 Comparison of test indexes in the elevated maze in three groups （xˉ±s）

圖2 3組高架十字迷宮活動軌跡圖Figure 2 Representative tracing of movement in the elevated maze in three groups

2.1.33組懸尾測試行為比較 3組小鼠懸尾靜止時間比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，模型組懸尾靜止時間明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組懸尾靜止時間明顯更低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖 3 3組懸尾測試熱區圖Figure 3 Heat maps in the tail suspension test in three groups

表3 3組懸尾測試指標比較（xˉ±s）Table 3 Comparison of suspension tail test indexes in three groups （xˉ±s）

2.2 3組DRN、PFC腦區c-fos表達水平比較

3組DRN、PFC腦區c-fos陽性神經元數量比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，模型組DRN、PFC腦區c-fos神經元數量均明顯降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組DRN、PFC腦區c-fos神經元數量均明顯更高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖4～5。

圖4 3組小鼠DRN腦區c-fos表達（×20）Figure 4 Expression of c-fos in the DRN in three groups （×20）

表4 3組DRN、PFC腦區c-fos陽性細胞數量比較（xˉ±s）Table 4 Comparison of the number of c-fos positive cells in the DRN，PFC in three groups （xˉ±s）

圖5 3組小鼠PFC腦區c-fos表達（×20）Figure 5 Expression of c-fos in the PFC in three groups （×20）

2.3 3組5-HT神經元數量比較

3組小鼠DRN腦區5-HT陽性神經元數量比較（P＜0.05）；與對照組比較，模型組DRN腦區5-HT神經元數量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組DRN腦區5-HT神經元數量明顯更高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖6、表5。

圖6 3組DRN腦區5-HT神經元表達（×20）Figure 6 Expression of 5-HT neurons in the DRN in three groups （×20）

表5 3組DRN腦區5-HT神經元數比較（xˉ±s）Table 5 Comparison of the number of 5-HT neurons in DRN in three groups（xˉ±s）

3 討 論

3.1 電針耳迷走神經可改善PMS模型小鼠焦慮、抑郁樣行為

通過曠場和高架十字迷宮測試可以檢測小鼠的焦慮樣行為［12］，懸尾測試反映小鼠的抑郁樣行為［13］。本研究結果顯示，PMS可以減少C57BL/6小鼠在曠場測試中總移動距離、中心區域時間百分比；減少高架十字迷宮測試中開臂花費時間、開臂總移動距離及進入開臂次數；增加懸尾測試中懸尾靜止時間。通過電針耳迷走神經干預后，電針組中心區域時間百分比和開臂花費時間均高于模型組，懸尾靜止時間低于模型組，這提示電針迷走神經干預可改善PMS所致小鼠焦慮、抑郁樣行為。這可能與以下因素有關：① 早期的生活經歷與個體的行為及神經發育密切相關［14］，PMS可引起個體焦慮及抑郁樣行為的發生，其作為一種慢性應激壓力，誘發了小鼠焦慮、抑郁樣行為的產生。抑郁癥在中醫學中屬于“郁證”的范疇，情思憂慮會導致氣行不暢，進而導致抑郁癥的出現［15］。耳穴中心、神門穴等位于耳甲區，刺激以上穴位分區可改善氣機郁滯，調整相應的臟腑功能。② 耳甲區分布著豐富的迷走神經，電針刺激耳甲區迷走神經，可影響迷走神經所屬的副交感神經系統，令其與交感神經系統共同調節機體內分泌系統的功能，從而改善個體情志狀態。

3.2 電針耳迷走神經改善PMS所致焦慮、抑郁樣行為可能與調節c-fos及5-HT的表達有關

本研究結果顯示，PMS可使小鼠PFC、DRN腦區的c-fos表達水平降低，DRN腦區5-HT神經元數量明顯降低。電針耳迷走神經后，電針組PFC、DRN腦區c-fos表達水平明顯上升，DRN腦區5-HT神經元數量明顯升高，這提示電針耳迷走神經改善PMS所致焦慮、抑郁樣行為可能與調節c-fos和5-HT的表達有關。這可能與以下因素有關：① 親本照顧缺失作為一種早期生活壓力對PFC、DRN腦區可產生持續性影響［16-17］，PMS小鼠PFC腦區活性、體積和厚度均明顯減少［18］。電針刺激耳甲區可激活PFC腦區，促進神經元c-fos的表達，有利于受損神經元的修復，從而改善PMS小鼠抑郁樣行為。這與FUCHIKAMI等［19-21］研究結果一致。② PMS小鼠DRN腦區5-HT神經元數量明顯減少［22-24］，DRN腦區5-HT神經元可投射到前腦邊緣區及大腦皮層，其神經元功能低下是抑郁癥的病理、生理基礎［25-26］。電針耳迷走神經干預后，TPH2的神經元表達水平提高，這提示電針刺激耳迷走神經使PMS小鼠5-HT神經元數量明顯增加，DRN腦區5-HT系統趨于穩定，從而改善其焦慮、抑郁樣情緒，這一改善可能依賴于調整5-HT相關受體的功能。其中，5-HT1A型受體（serotonin1Areceptor，5-HT1AR）是與抑郁癥關系最密切的受體之一，在PFC腦區大量表達［27-28］。但其是否通過調控5-HT1A型受體以改善PMS誘發的焦慮、抑郁樣行為尚不清楚，還需要下一步繼續深入研究。

4 小 結

電針耳迷走神經可以改善PMS小鼠焦慮、抑郁樣行為，其作用機制可能與改善c-fos表達水平，增加DRN腦區5-HT神經元的數量相關。