新發(fā)突變家系植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的單倍型構(gòu)建方法探索

徐惠玲，吳正中，付志紅，張華坤，范晶，李雪梅

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院，深圳 518048)

在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)中，一般活檢1～2個(gè)卵裂期細(xì)胞或者5～10個(gè)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞用于分析。每個(gè)細(xì)胞大約只含6 pg DNA，如此少的遺傳物質(zhì)阻礙了下游的基因檢測(cè)[1-2]。目前的主流方法是將胚胎活檢細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)，包括多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)、多重置換擴(kuò)增技術(shù)(MDA)和簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)等方法，將pg級(jí)的遺傳物質(zhì)放大到ng級(jí)，然后再進(jìn)行基因突變的檢測(cè)[3-4]。但是在WGA的過(guò)程中，容易出現(xiàn)等位基因脫扣(ADO)現(xiàn)象，造成誤診[2]，尤其對(duì)于顯性遺傳的突變來(lái)說(shuō)，ADO更是可能直接造成有疾病表型的后代。因此，目前單基因病胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-M)主要采用胚胎WGA產(chǎn)物進(jìn)行目標(biāo)變異位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)合家系單倍型連鎖分析檢測(cè)策略[5]。常規(guī)的家系單倍型連鎖分析需要先證者患兒或是其他核心家系成員，而對(duì)于致病位點(diǎn)為新發(fā)突變且未妊娠過(guò)患兒的夫妻，常規(guī)的家系連鎖分析無(wú)法滿(mǎn)足檢測(cè)。

本研究納入的3個(gè)家系均為夫妻一方本身為患者而致病變異在其核心家系未找到來(lái)源，經(jīng)遺傳咨詢(xún)判定為新發(fā)突變，且夫妻雙方未妊娠過(guò)患兒。對(duì)于男方為新發(fā)突變患者，我們采用了單精子測(cè)序技術(shù)構(gòu)建家系單倍型；對(duì)于女方為新發(fā)突變患者，我們采用了胚胎互推策略進(jìn)行致病性單倍型的確定，以此探討不同的單倍型構(gòu)建方法在新發(fā)突變家系中的PGT應(yīng)用性及有效性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年4月至2021年12月于本生殖醫(yī)學(xué)中心就診并接受遺傳咨詢(xún)和輔助生殖助孕的患者。共納入了3對(duì)，其中一方為遺傳病患者且致病變異未找到來(lái)源的夫婦(表1)。家系1中存在突變的為女方，30歲，為雙腎多發(fā)性復(fù)雜性囊腫患者，PKD1基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Exon 37存在c.10838T>C雜合突變。家系2中存在突變的為男方，32歲，出生后即發(fā)生溶血性貧血，血紅蛋白濃度(HGB) 60～70 g/L，B超提示脾臟腫大，2000年行脾切除術(shù)，血涂片顯微鏡檢查疑球形紅細(xì)胞增多癥，基因檢測(cè)結(jié)果為ANK1：c.3641delC，診斷為Ⅰ型球形紅細(xì)胞增多癥。家系3中存在突變的為男方，32歲，8年前逐漸出現(xiàn)耳鳴、眩暈、嘔吐、視力障礙，頭顱MRI顯示雙側(cè)橋小腦區(qū)結(jié)節(jié)狀病變，與雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng)關(guān)系緊密，腦干受壓和左側(cè)三叉神經(jīng)受壓，診斷為雙耳神經(jīng)纖維瘤，后行顱內(nèi)纖維瘤切除術(shù)，術(shù)后雙耳聽(tīng)力喪失，基因檢測(cè)結(jié)果為NF2：c.861delC。上述3個(gè)家系中疾病的遺傳方式均為常染色體顯性遺傳，3個(gè)患者的父母此前在外院均未檢測(cè)到與患者相同的致病變異，家族中沒(méi)有相同癥狀的患者。該3對(duì)夫婦要求進(jìn)行PGT，阻斷疾病在下一代的傳遞。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書(shū)。

表1 三個(gè)家系患者相關(guān)資料

二、研究方法

1.體外受精及囊胚活檢：對(duì)3個(gè)家系女方進(jìn)行臨床控制性促排卵(COH)，注射HCG 36～38 h后進(jìn)行取卵。通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)進(jìn)行授精，并于授精后15～18 h觀察原核，評(píng)估受精情況。胚胎在溫度為37℃，氣體濃度為5%O2、6%CO2和89%N2的條件下采用序貫培養(yǎng)法(G1、G2，Vitrolife，瑞典)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天(D3)下午對(duì)透明帶進(jìn)行激光打孔，孔徑為10 μm。囊胚觀察采用Gardner評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]。選擇D5、D6囊胚腔充分?jǐn)U張的囊胚用激光法進(jìn)行活檢，具體操作是持卵針控制胚胎，活檢針控制遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)滋養(yǎng)層區(qū)域，在孵出區(qū)域激光擊打使其皺縮，并切割下5～10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞?；顧z下的細(xì)胞用不含Mg2+和Ca2+的 1×PBS 溶液清洗3次后，保存在含有5 μl細(xì)胞裂解液的PCR管中?；顧z后的胚胎均使用玻璃化冷凍試劑盒(VT101，Kitazato，日本)進(jìn)行冷凍。

2.單精子分離及一代測(cè)序分析：家系2和家系3均是男方為新發(fā)突變，我們采用單精子測(cè)序的方法構(gòu)建單倍型。對(duì)男方新鮮射出的精液進(jìn)行梯度密度離心后，用PBS稀釋至適宜濃度，在顯微鏡觀察下使用口吸管挑取單個(gè)精子，放置于含有5 μl裂解液的PCR管中短暫離心，共挑取20～30條精子。分離后的單精子和胚胎活檢樣本使用MALBAC的方法進(jìn)行WGA，WGA產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)300～2 000 bp彌散條帶即為擴(kuò)增成功。擴(kuò)增成功后，對(duì)胚胎活檢樣本及單精子WGA產(chǎn)物進(jìn)行致病變異的一代測(cè)序驗(yàn)證。

3.單倍體分析及拷貝數(shù)變異(CNV)檢測(cè)：將3對(duì)夫婦外周血DNA樣本、活檢胚胎細(xì)胞及單精子WGA產(chǎn)物進(jìn)行高通量靶向Panel測(cè)序(100X)，在突變位點(diǎn)兩端選取有效單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。家系2和家系3利用單精子及夫妻外周血的靶向測(cè)序結(jié)果，即可判斷男方突變所在的染色體，據(jù)此再判斷其胚胎致病變異攜帶狀態(tài)(圖1 A)。家系1中女方為新發(fā)突變患者，采用胚胎互推的策略進(jìn)行檢測(cè)，將一代測(cè)序結(jié)果為攜帶突變的胚胎作為家系“先證者”，結(jié)合夫婦及剩余其他胚胎靶向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行單倍型綜合分析，判斷胚胎是否攜帶致病變異(圖1 B)。同時(shí)，為了避免染色體異常帶來(lái)的流產(chǎn)、死胎、畸形患兒的出生，除了致病基因的檢測(cè)以外，我們還對(duì)每個(gè)活檢胚胎進(jìn)行了CNV的檢測(cè)，報(bào)告范圍為大于10 Mb及嵌合比例大于30%的CNVs。

A：家系2和家系3采用的單精子測(cè)序構(gòu)建單體型技術(shù)；B：家系1采用的胚胎互推策略構(gòu)建單倍體型技術(shù)；“O”代表野生型位點(diǎn)，“X”代表致病變異位點(diǎn)。

4.胚胎植入及產(chǎn)前診斷：根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，將染色體正常且不攜帶致病變異的胚胎復(fù)蘇后移植入子宮，移植后第10天檢測(cè)患者HCG水平；移植后35 d，B超檢測(cè)孕囊和胎心，判斷是否妊娠。孕中期進(jìn)行羊水穿刺驗(yàn)證PGT結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié) 果

一、胚胎培養(yǎng)及活檢情況

3個(gè)家系一共獲卵61枚，其中有49枚為成熟卵母細(xì)胞，這49枚均正常受精，受精率為100%。D3一共有46枚胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)24枚(表2)，囊胚形成率為52.2%，所有胚胎活檢樣本均WGA擴(kuò)增成功，WGA成功率為100%。

表2 家系胚胎培養(yǎng)及活檢情況

二、單精子分離及一代測(cè)序結(jié)果

家系2和家系3各有4份單精子樣本擴(kuò)增成功，均其中2份攜帶男方致病變異位點(diǎn)，2份檢測(cè)結(jié)果為野生型，其中家系2檢測(cè)的是單精子的ANK1：c.3641delC位點(diǎn)(圖2 A)，家系3檢測(cè)的是單精子的NF2：c.861delC位點(diǎn)(圖2 B)。

A：家系2單精子測(cè)序結(jié)果；B：家系3單精子測(cè)序結(jié)果；紅框內(nèi)為突變位點(diǎn)。

三、胚胎基因型及CNV檢測(cè)結(jié)果

3個(gè)家系一共檢測(cè)了24個(gè)囊胚(表3)。其中家系1的E1-5及E1-14號(hào)胚胎一代測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)了ADO現(xiàn)象，ADO率為8.3%(2/24)，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了進(jìn)行連鎖分析的必要性。CNV的檢測(cè)結(jié)果顯示，24個(gè)囊胚中20個(gè)核型為46，XN的胚胎，整倍體率為83.3%(20/24)；有4個(gè)染色體片段拷貝數(shù)異常的胚胎，4個(gè)均為嵌合體胚胎，嵌合比例為16.7%(4/24)。

表3 三個(gè)家系胚胎檢測(cè)及處理結(jié)果

續(xù)表

四、胚胎移植及隨訪(fǎng)結(jié)果

3個(gè)家系分別移植了1枚不攜帶致病變異的整倍體胚胎。家系1移植了E1-1號(hào)胚胎后第10天，女方β-HCG檢測(cè)數(shù)值為254.52 U/L；移植術(shù)后第39天，B超檢查可見(jiàn)胎心胎芽；孕19周羊水穿刺檢查結(jié)果為：46，XN，且不攜帶PKD1：c.10838T>C變異；孕37周順產(chǎn)一名2 220 g健康女?huà)?。家?移植了E2-1號(hào)胚胎后第9天，β-HCG檢測(cè)數(shù)值為474.45 U/L；移植術(shù)后第31天，B超檢查可見(jiàn)胎心胎芽；孕17周羊水穿刺結(jié)果為46，XN，且不攜帶ANK1：c.3641delC致病變異，撰稿時(shí)為妊娠第24周。家系3移植了E3-1號(hào)胚胎后第9天，β-HCG檢測(cè)數(shù)值為252.03 U/L，孕18周羊水穿刺結(jié)果為46，XN，且不攜帶NF2：c.861delC致病變異，撰稿時(shí)為妊娠第20周。

討 論

PGT-M與產(chǎn)前診斷相結(jié)合，從理論上講能從源頭阻止患病胎兒的妊娠，避免了妊娠患病胎兒給孕婦帶來(lái)的身體傷害、給孕婦家庭及社會(huì)帶來(lái)的沉重負(fù)擔(dān)。目前，針對(duì)胚胎活檢細(xì)胞的WGA方法均存在一定概率的ADO，在單細(xì)胞水平，MALBAC擴(kuò)增的ADO率為4.55%，MDA擴(kuò)增的ADO率為22.5%，雖然使用5個(gè)以上細(xì)胞作為起始模板，ADO率會(huì)顯著下降，但是仍存在誤診的可能[8]。利用突變位點(diǎn)兩端的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)或SNP位點(diǎn)進(jìn)行家系單倍型連鎖分析是解決ADO的主流方法，而家系成員的缺失及新發(fā)突變無(wú)法完成常規(guī)的疾病連鎖分析。

本研究納入的3個(gè)家系均為新發(fā)突變。據(jù)報(bào)道，新發(fā)突變發(fā)生概率與父親母親年齡、基因組結(jié)構(gòu)、突變類(lèi)型等因素相關(guān)[9-11]。家系1所涉及的常染色體顯性多囊腎屬于新發(fā)突變率較高的一種疾病，該疾病的新發(fā)突變率可達(dá)10%～15%[12-13]。據(jù)估計(jì)，父母表型正常的球形紅細(xì)胞增多癥患兒多達(dá)50%是由ANK1新發(fā)突變所導(dǎo)致[14]。NF2基因突變導(dǎo)致的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤50%由新發(fā)突變導(dǎo)致，剩余患者是從受累的父母中遺傳而來(lái)[15]。隨著PGT-M技術(shù)的成熟和應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如何對(duì)攜帶新發(fā)突變夫妻的胚胎進(jìn)行基因檢測(cè)，也需要更多的研究和實(shí)踐。

近年來(lái)，已有研究探討和解決了新發(fā)突變及家系成員缺失的單倍型連鎖分析。如2021年，Wang等[16]從ADPKD新發(fā)突變患者受累胚胎確定了“高危型”和“低危型”的單倍體，當(dāng)送檢胚胎一代測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)受累胚胎作為“先證者”時(shí)，可利用患者單精子或極體測(cè)序結(jié)果判斷胚胎的致病變異攜帶狀態(tài)。此外，有學(xué)者利用Pacbio第三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)確定了2對(duì)攜帶單基因致病突變夫婦的致病突變所在染色體，再與胚胎SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍體型分析，從而判斷胚胎疾病的攜帶狀態(tài)[17]。第三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序在解讀復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)等方面有其優(yōu)越性，比如可以解決多囊腎疾病中的假基因同源性高的問(wèn)題，但是其成本較高、通量較小、分辨率較低，目前應(yīng)用還僅處于科學(xué)研究階段，并未在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行推廣。還有學(xué)者利用10X Genomics技術(shù)對(duì)2對(duì)分別攜帶地中海貧血以及Norrie疾病突變基因的夫婦，在不依賴(lài)先證者以及相關(guān)家系成員的情況下，完成了PGT-M的單倍型連鎖分析，移植后兩對(duì)夫婦均獲得了健康的后代[18]。但是該種方法在GC含量高、高度重復(fù)等復(fù)雜基因組區(qū)域不能保證單倍型分型成功，此外由于成本較高，適用性受到限制。

本研究針對(duì)不同性別攜帶的新發(fā)突變采取了兩種單倍型分析策略。家系2、3為男方攜帶新發(fā)突變，我們分離男方單精子進(jìn)行測(cè)序及致病位點(diǎn)的驗(yàn)證，直接分別鎖定致病突變及野生型位點(diǎn)所在染色體上下游的SNP基因型，然后再分析胚胎中SNP基因分型就能對(duì)胚胎致病性進(jìn)行判斷。由于男性精子數(shù)量龐大，因此單倍型構(gòu)建成功率高，但是操作較為繁瑣，分離的單精子有WGA失敗的可能。家系1為女方攜帶新發(fā)突變，我們對(duì)其胚胎進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)一代測(cè)序以及上下游SNP位點(diǎn)的靶向測(cè)序，將一代測(cè)序結(jié)果顯示為攜帶致病變異的胚胎作為“先證者”，與夫妻雙方進(jìn)行單倍型連鎖分析，之后分析和驗(yàn)證剩余胚胎的基因型。這種利用胚胎結(jié)果互推的策略，需要送檢的樣本中有攜帶致病突變的胚胎，當(dāng)一代測(cè)序均未檢測(cè)出異常胚胎時(shí)，需要進(jìn)行第2次促排或者利用極體進(jìn)行單倍型分析。但是極體活檢存在一定技術(shù)難度，極體容易出現(xiàn)碎裂、降解等情況，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。同時(shí)并非所有卵母細(xì)胞都能受精發(fā)育到囊胚階段，因此，存在無(wú)效活檢的情況[19]。

綜上所述，本研究報(bào)道了3例新發(fā)突變的家系，包括c.10838T>C導(dǎo)致的常染色體顯性多囊腎、ANK1：c.3641delC突變導(dǎo)致的Ⅰ型球形紅細(xì)胞增多癥，以及NF2：c.861delC導(dǎo)致的Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤，后2個(gè)變異位點(diǎn)均為國(guó)際首次報(bào)道，豐富和拓展了相關(guān)疾病的遺傳圖譜。同時(shí)針對(duì)這3個(gè)家系我們采用了突變位點(diǎn)直接檢測(cè)加上2種不同的單倍體型分析策略，使3個(gè)家系均成功妊娠且通過(guò)了產(chǎn)前診斷檢測(cè)，其中1個(gè)已分娩未攜帶親本致病變異新生兒。實(shí)踐證明，利用單精子測(cè)序技術(shù)和胚胎互推策略可以實(shí)現(xiàn)攜帶新發(fā)突變的夫婦或是家族成員不全的家系PGT-M的檢測(cè)。