中心靜脈導管監測肺動脈壓的兔急性肺栓塞模型的制備

龍嘉琪趙文麗彭發全吳 蓓李躍兵

(1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院,杭州 310053;2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院病理科,杭州 310005;3.浙江中醫藥大學附屬第二醫院麻醉科,杭州 310005)

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism,APE)是內源性或外源性栓子堵塞肺循環系統導致的一系列病理生理綜合征。 它是全球死亡的一個重要原因,僅2018 年就有10 萬多人死亡[1]。 APE 是西方國家住院患者心血管疾病死亡的第三大常見原因,僅次于冠心病和腦卒中[2-3]。 它起病兇險,因其癥狀不典型,缺乏特異性,極易漏診和誤診,病死率高[4]。 早期診斷和干預至關重要,因為大多數APE死亡發生在最初幾個小時至幾天內,70%以上的死亡發生在1 h 內[5]。 因此建立一種栓塞范圍及嚴重程度可控的動物模型用于實驗研究十分重要,對于新藥、新的診療器械和方法的開發與評估具有重要意義。 目前用于APE 模型制備的動物有很多,比如猴、豬、狗、兔、鼠等,但兔的纖溶系統、肺組織結構以及血管形態與人類更接近,因此,認為兔模型是APE 比較理想的模型[6]。 當前,制備APE 模型的方法也有很多,采用導管測量肺動脈壓(pulmonary arterial pressure,PAP)是較為常用的方法[7],但在術中準確測量PAP 較為困難。 Yu 等[8]、賈振宇等[9]在X 線引導下,將導管置入肺動脈監測PAP,該方法復雜、昂貴且具有放射性。 也有人采用傳統的頸外靜脈置管法測量肺動脈壓,其中大部分是根據實驗動物的解剖結構直接插管的[10-11],耗時且成功率較低。 本研究是對傳統頸靜脈插管方法的進一步改進。 通過在導絲的引導下將塑形的單腔中心靜脈導管置入肺動脈,成功制備了可實時監測PAP 的兔APE 模型。 此外,建立理想的APE 模型需要解決兩個問題:一是如何將血栓引入肺動脈;二是如何控制肺栓塞的嚴重程度。 本研究有效地解決了這兩個難題。 既保證了血栓的完整性,又實現了PAP 的實時動態監測。 根據要達到的PAP 來控制注入血栓的數量,使APE 模型的嚴重程度能夠“可視化”,有效地建立了栓塞范圍和嚴重程度可控的動物模型。 該方法成功率高、操作簡單、經濟適用,為急性肺栓塞的診斷和治療相關研究提供了實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雄性新西蘭兔6 只,5 月齡,體重2.5～3.0 kg,購自新昌縣大市聚鎮欣健兔場[SCXK(浙)2020-0005],飼養于浙江中醫藥大學濱文校區動物中心普通環境[SYXK(浙)2018-0012],溫度為20℃～25℃,相對濕度為60%～70%。 實驗動物的使用遵循了3R 原則,所有實驗操作均獲浙江中醫藥大學動物倫理委員會批準(IACUC-20201102-03)。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(批號:20102001,廠家:深圳市瑞沃德生命科技有限公司);肝素鈉(批號:2006106,廠家:上海上藥第一生化藥業有限公司)。 中心靜脈導管套 件( 規 格: 5 Fr、 單 腔 20 cm、 16 Ga, 批 號:M201000013,廠家:新加坡柏盛國際有限公司);手術器械(批號:20200802,廠家:張家港市浦倫醫療器械有限公司);Medlab 生物信號采集處理系統(U/4C501H,南京美易科技有限公司);電熱恒溫水槽(CU-600 型,上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 研究設計

選取6 只雄性新西蘭兔來建立一種栓塞范圍和嚴重程度可控的急性肺栓塞兔模型。 所有的動物都遵循相同的規程(如圖1),并作為自身前后對照。術前制備好自體血栓以及對中心靜脈導管塑形。麻醉誘導后,行股動脈穿刺,動態監測兔血壓和心率。 隨后在導引鋼絲的引導下從兔頸外靜脈置入中心靜脈導管至肺動脈,并連接Medlab 生物信號采集系統行肺動脈壓動態監測。 麻醉誘導后約120 min 后,注入自體血栓,當平均肺動脈壓達到25 mmHg 時停止注栓,待穩定后記錄血流動力學參數,評估過程持續時間約為30 min。 約180 min 時,對兔實施安樂死,并進行心肺解剖,觀察中心靜脈導管所在位置和血栓分布情況,以及對肺組織行病理檢查。

圖1 家兔肺栓塞模型制作流程圖Figure 1 Flowchart of making rabbit pulmonary embolism model

1.3.2 血栓制作

從實驗兔耳緣靜脈取血3 mL,裝入無菌聚乙烯管中,室溫靜置30 min,自凝后,于37℃電熱恒溫水槽加熱2 h,用手術刀裁剪成直徑為1.5 mm,長為4 mm 的柱形血栓(如圖2),用無菌生理鹽水反復沖洗后,置于4℃冰箱備用。

圖2 血栓制作示意圖Note. a, Removing the thrombus from the polyethylene tube. b/c, Thrombus was cut into a cylindrical thrombus with a diameter of 1.5 mm and a length of 4 mm.Figure 2 Schematic diagram of thrombus

1.3.3 導管塑形

將縫合針彎曲為半徑為3 mm 左右的圓滑弧型,將塑形好的縫合針置于中心靜脈導管的藍色端,于60℃電熱恒溫水槽加熱2 h 塑形。 自然冷卻后,拔出縫合針,導管形狀(如圖3),導管前端的弧形有利于導管鉤掛于主肺動脈,不容易從肺動脈滑出。 導引鋼絲前端彎曲的半徑為3 mm 左右的圓滑弧型(如圖4),該弧度與右室壁和肺動脈所形成的弧度相似,可避免導管在右心室內繞圈折返,而更容易進入肺動脈。 有研究表明導管前端彎曲比前端筆直置入時間縮短,并可減少右心耳和右心室穿孔等心血管損傷的風險[11]。 可利用導引鋼絲這一特點在其導引下置入中心靜脈導管而到達肺動脈。

圖3 中心靜脈導管塑形Note. a, Placing the curved suture needle into the central venous catheter. b, Shape of the catheter after cooled.Figure 3 Shapping the central venous catheter

圖4 導引鋼絲Note. a, A smooth arc guide wire with a front bending radius of about 3 mm. b, Overall view of guide wire.Figure 4 Guide wire

1.3.4 麻醉

采用3%的戊巴比妥鈉溶液按1 mL/kg 的劑量,經耳緣靜脈注射麻醉實驗兔,麻醉后用棉繩將其四肢固定于手術板上,術中吸入異氟烷和空氣的混合氣體,用面罩罩住實驗兔的嘴巴和鼻子維持麻醉。 右側大腿根部備皮、消毒、鋪巾,手術切口右側腹股溝區皮膚,暴露右側股動脈,置入22 G 靜脈針,與三通管Medlab 生物信號采集處理系統相連,監測有創血壓,如圖5。

圖5 實驗兔麻醉后,于右側股動脈監測有創動脈血壓Figure 5 After anesthesia, the blood pressure of the femoral artery was monitored

1.3.5 肺動脈置管

常規右側頸前區備皮、消毒、鋪巾,手術切口右側頸前區皮膚,暴露右側頸外靜脈。 于右側頸外靜脈近心端處,采用血管夾阻斷血流,待血管充盈后,行遠心端結扎,楔形剪開靜脈血管,將上述制備的中心靜脈導管內充滿肝素鹽水,插入右側頸外靜脈。 由于導管較軟,不易通過三尖瓣。 此時可將導引鋼絲置入于中心靜脈導管,在導引鋼絲的引導下,使中心靜脈導管經過右心房、右心室到達肺動脈。 插入過程中,保持中心靜脈導管和導絲的弧向下方,并根據插管的標記判斷到達心臟部位,將插管左旋并向前推進。 到達肺動脈后,利用頭端的彎曲使導管前端鉤掛于肺動脈瓣上,然后退出導引鋼絲,將中心靜脈導管通過三通管壓力換能器和Medlab 多通道生物信號分析系統相連。 此時密切觀察生理記錄儀顯示屏,當壓力基線上升并出現肺動脈波形時(如圖6),立即將導管固定,并開始描記肺動脈壓。 如果插管失敗,可將導管回拉1 cm 左右,再次向前推進,直到出現肺動脈壓波形。 最后縫合頸部切口。

圖6 從右房至右室再到肺動脈的壓力波形變化Note. Black arrow, Catheter is in the right atrium and the pressure is low. Blue arrow, Catheter is in the right ventricle, and the fluctuation of the pressure curve increases. Green arrow, Catheter in the pulmonary artery, and the fluctuation of the pressure curve decreases (at 500 ms/Div).Figure 6 Pressure waveform changes from right atrium to right ventricle and then to pulmonary artery

1.3.6 栓子注入

用注射器經導管注入自體血栓與生理鹽水的混合液5 mL,血栓注入時,控制注入速度,每注入一條血栓間隔30 s,當注入血栓約5～7 個,平均肺動脈壓達到25 mmHg 時停止輸注。

1.3.7 心肺解剖

數據采集結束后,過量麻醉(3%異戊巴比妥鈉100 mg/kg)處死家兔。 解剖心臟及肺動脈,觀察導管所在位置以及肺動脈內是否有栓子存在。

1.3.8 病理標本制作

觀察肺組織外觀,沿肺梗死區尋找血栓,并于血栓所在區域取材,切取肺組織塊,灌注沖洗后甲醛固定48 h,常規乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。 本實驗屬于自身配對設計,對連續性變量進行正態性檢驗,符合正態分布的計量資料用平均數±標準差(±s)表示,采用配對t檢驗進行比較;非正態分布計量資料采用秩和檢驗。 以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型建立結果

6 只實驗兔于血凝塊注入即刻出現呼吸、心跳加快,血壓一過性升高后出現下降,鼻翼扇動,呼吸困難,腹式呼吸加強,伴嘴唇紫紺,雙肺可聞及干濕羅音,個別可聞及高調哮鳴音,少數有短暫嗆咳,部分可見明顯肌肉顫動,持續約15～30 min 好轉。 實驗觀察期間,均無死亡,建模成功率100%。

2.2 血流動力學指標

記錄注栓前后的兔肺動脈壓、血壓、心率,所得壓力波形(如圖7)。

圖7 注栓前后血流動力學參數的變化Note. a, Hemodynamic parameters of an experimental rabbit before embolization. PAP, 21/14 mmHg. MPAP, 16 mmHg. BP, 75/46 mmHg. HR,171 bpm. b, After the injection of 5 embolus, the MPAP of the experimental rabbits reached 25 mmHg and the embolus was stopped, and the hemodynamic parameters were observed 5 min later. PAP, 31/23 mmHg. BP, 63/48 mmHg. HR, 152 bpm (PAP, Pulmonary arteria pressure.BP, Blood pressure. HR, Heart rate, at 500 ms/Div).Figure 7 Hemodynamic changes before and after embolization

2.3 血流動力學檢測結果

對血栓注入前后的血流動力學進行比較,SPAP、DPAP、MPAP 均升高,MBP、SBP、HR 均降低,差異均有統計學意義(P<0.05),如表1 和圖8。

圖8 注栓前后兔的SPAP、DPAP、MPAP、MBP、SBP、HR 變化趨勢的比較(n=6)Note. a～f, Changes of SPAP, DPAP, MPAP, MBP, SBP and HR in rabbits before and after embolization. c, Controls the number of embolus injection according to the target pulmonary artery pressure of 25 mmHg, so the pulmonary artery pressure after embolization is the same.Compared with before embolization, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.Figure 8 Comparison of SPAP, DPAP, MPAP, MBP, SBP and HR before and after embolization

表1 注栓前后兔SPAP、DPAP、MPAP、MBP、SBP、HR 的比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of SPAP, DPAP, MPAP, MBP, SBP and HR in rabbits before and after embolization

表1 注栓前后兔SPAP、DPAP、MPAP、MBP、SBP、HR 的比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of SPAP, DPAP, MPAP, MBP, SBP and HR in rabbits before and after embolization

注:SPAP:肺動脈收縮壓;DPAP:肺動脈舒張壓;MPAP:平均肺動脈壓;MBP:平均動脈壓;SBP:動脈收縮壓;HR:心率。Note. SPAP, Systolic pulmonary arteria pressure. DPAP, Diastolic pulmonary arteria pressure. MPAP, Mean pulmonary arterial pressure. MBP, Mean arterial pressure. SBP, Systolic arterial pressure. HR, Heart rate.

組別Groups SPAP(mmHg) DPAP(mmHg) MPAP(mmHg) MBP(mmHg) SBP(mmHg) HR(bpm)注栓前Before embolization 19.5±2.8 10.2±3.0 13.0±2.5 73.8±20.2 92.2±24.6 185.7±30.7注栓后After embolization 34.2±2.3 20.3±1.76 25.0±0.0 63.3±19.7 78.2±24.5 166±34.5 t 值 t value -7.546 -12.200 -11.619 3.548 3.863 4.963 P 值P value <0.001 <0.0001 <0.0001 <0.05 <0.05 <0.01

2.4 病理結果

2.4.1 肉眼觀察

(1)導管在肺動脈內

打開實驗兔胸腔,剪開右心室,找到導管末端,可觀察到導管末端鉤掛于主肺動脈(如圖9)。

圖9 實驗兔的心肺解剖Note. a, Schematic diagram of heart and lung after opening the chest. b, Cut open the right ventricle to expose the catheter.Yellow arrow, Pulmonary artery. Green arrow, Aorta. Blue arrow, Superior vena cava.Figure 9 Cardiopulmonary anatomy of experimental rabbits

(2)肺內發現血栓條

對APE 兔離體肺組織標本進行肉眼觀察,并沿肺動脈走形剪開血管,尋找血栓。 于肺葉動脈及以上肺動脈內和肺段動脈及以下均發現血栓若干(如圖10)。 大多數栓子栓塞于肺動脈段水平,多分布在膈葉動脈及其前基底段支、外基底段支、后基底段支,少量分布于尖葉和心葉,且右葉檢塞率明顯高于左葉。

圖10 肺內發現血栓條Note. a, Thrombus was found in the left lower lung. b,Thrombus was found in the right lower lung. Black arrows,Thrombus.Figure 10 Thrombus strips found in lung

2.4.2 顯微鏡下觀察病理改變

對光,調整好放大倍數,在光學顯微鏡下觀察兔APE 肺組織病理改變。 顯微鏡示兔肺動脈管腔內見較大血栓,以混合血栓為主;部分血管內皮細胞脫落壞死,纖維素樣變性;動脈內膜平滑肌細胞部分透明及黏液樣變性,動脈壁增厚,向腔內形成突起,彈力纖維增生,以及左心室壁肥厚(如圖11)。

圖11 圖11 肺栓塞后實驗兔肺組織病理改變(HE 染色)Note. a, Pulmonary artery thrombosis. b, Endothelial cell necrosis and shedding, thrombosis. c, Arterial wall thickening, partial endothelial cell shedding. d, Endothelial cells abscission and fibrinoid degeneration. e, Arterial wall thickening and protruding into the lumen. f, Left ventricular wall thickening.Figure 11 Pathological changes of experimental rabbit lung tissue after pulmonary embolism(HE staining)

3 討論

在研究中,我們通過中心靜脈導管建立了肺動脈栓塞的“可視化”模型。 建模成功率高達100%。如圖9 所示,心肺解剖證實導管位于肺動脈主干。如圖10、圖11 所示,組織病理學檢查顯示肺動脈和肺小動脈血栓形成,是診斷肺栓塞的金標準。 穩定可靠的動物模型是研究APE 發病機制和評估藥物療效的重要手段。 建立理想的APE 模型需要解決兩個主要的問題:將栓子確切地引入肺動脈和有效地控制肺栓塞的嚴重程度。 我們的發現有助于解決這些問題。 首先,該方法確保了栓子的完整性。通過從頸外靜脈置入中心靜脈導管至肺動脈,自體血栓在進入肺動脈前一直在導管中流動,避免了其分解和自溶;另外,導管尖端位于肺動脈,血栓會確切地進入肺動脈。 其次,值得注意的是,以往多根據肺血管內血栓的形狀、分布、及血栓量來評估APE 的病情嚴重程度是不準確的,由于血栓量的多少與病情的嚴重程度并不一定呈平行關系[12]。 肺動脈壓對急性肺栓塞的嚴重程度和危險分層有一定的指導作用[13-14]。 因此在本研究中,采用的是控制相同的PAP 的方法來確保肺栓塞的嚴重程度一致。

肺栓塞引起的肺動脈壓的改變是肺循環障礙的重要臨床表現和診斷依據[15]。 在心臟的4 個腔室的右心室栓塞是最危險的,表現出更多的血流動力學不穩定性[16]。 栓子從右心室脫出,栓塞肺血管,導致肺血管橫截面積減少,肺血管阻力漸進性增加。 肺動脈有比較好的代償功能,當栓子比較小且量不多時,肺動脈的橫截面積減少低于30%時不會引起肺動脈壓力升高;但當栓子比較大且量較多時,導致栓塞面積過大,肺動脈的橫截面積減少超過30%～50%時,會使肺動脈壓力升高[17]。 因此,肺動脈壓監測被廣泛應用于肺栓塞和肺動脈高壓的診斷和治療評價[18]。 右心導管測量MPAP 是診斷肺動脈高壓的金標準。 肺動脈高壓的血流動力學診斷標準為右心導管在海平面靜止時測得的MPAP 為25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)[19]。 故在本研究中,當MPAP 超過25 mmHg 時即停止注入栓子。

通常用于引入栓子的外周靜脈為耳緣靜脈、頸外靜脈或股靜脈等,但由于受限于外周靜脈血管的直徑,僅能引入直徑較小的栓子,造成周圍性肺栓塞。 雖然通過節段性阻斷下腔靜脈能夠在原位形成較大血栓,釋放后形成中央型肺栓塞,但是這種方法操作繁瑣,并且栓子大小不容易控制,肺動脈栓塞程度難以一致。 兔的肺動脈分支較小,主肺動脈直徑約為4～8 mm,左、右肺動脈主干約為2.5～5.0 mm,肺段動脈為1.0～2.5 mm。 因此本研究將自體血栓剪成1.5 mm×1.5 mm×4 mm 的柱形血栓,一方面可以保證栓子不阻塞肺動脈主干,防止急性右心衰竭而致死亡;另一方面,自體血栓經中心靜脈導管送入主肺動脈處,血栓能確切地進入肺動脈并避免了血栓的自溶,尸檢及病理學檢查均顯示栓子較恒定地嵌頓于雙側下肺動脈內,因此不同個體間肺栓塞程度趨于一致。 該方法成功地模擬了人類肺栓塞的形成過程,同時通過肺動脈壓控制肺栓塞面積不至于過大。

本研究是對傳統頸靜脈插管方法的進一步改進。 通過放置中心靜脈導管和導絲,成功制備了可實時監測PAP 的兔APE 模型。 該模型具有以下優點:第一,導絲前端塑形的弧度與右室壁和肺動脈所形成的弧度相似,便于進入肺動脈,避免在心室內折返。 此外,導絲具有良好的韌性和可控性。 與直接置管相比,避免了軟導管造成的置管困難,可顯著縮短手術時間。 第二,中心靜脈導管前端的彎弧可使其更牢固地鉤住肺動脈瓣,避免其從肺動脈脫垂。 第三,導管前端放置于目標肺血管,可選擇性地置入肺血栓主體中,為局部接觸性溶栓、碎栓和吸栓等肺動脈腔內介入治療提供便捷的操作,對評價導管技術及藥物干預措施等APE 診治的相關研究提供實驗基礎[20]。 第四,模型的栓塞范圍和嚴重程度可控。 因此,該方法對APE 的研究具有較高的科學和臨床價值。 然而,本研究方案也存在一定的局限性,由于實驗設備的不足,未能測定家兔的心排量和分析其血氣變化,若在后續的研究中進行補充,將會使該肺栓塞模型更加完善以及具有更加重要的臨床指導意義。

綜上所述,此種方法建立的APE 模型操作方便、成功率較高、經濟適用。 通過導引鋼絲引導,中心靜脈導管較容易置入到肺動脈,且能實時、連續監測PAP。 根據所要達到的PAP 來控制注入栓子的數量,使APE 模型的嚴重程度變得“可視化”。因此,本研究很好地解決了APE 模型制備的兩大難題,既保證了栓子能確切地進入肺動脈,又有效地控制了肺栓塞的嚴重程度,是一種穩定性和可靠性較高的急性肺栓塞模型。 本方法操作簡便且接近真實的病理狀態,具有很高的科研價值和可行性,可作為動物實驗研究及臨床研究的理想模型。