高糖高脂食物對BALB/c 和C57BL/6J 小鼠生長和代謝指標改變影響的研究

戴麗軍黃月玲葉炳飛鄺桂星侯 敏安勝利

(1.廣州醫科大學實驗動物中心,廣州 511436;2.廣州市番禺區第六人民醫院,廣州 511442;3.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院,廣州 510095;4.南方醫科大學公共衛生學院生物統計系,廣州 510515)

長期以來,富含脂肪的食物與腫瘤發生風險之間的相關性一直是流行病學研究的重點[1-2]。 喜食高脂、高糖、高油、腌熏食品等的不良飲食習慣,富含脂肪和纖維含量低的食物,均會增加人類罹患癌癥的風險并使腫瘤發生率顯著升高[3-4]。 多項研究表明,高糖、高脂或高糖高脂(high-surcose-high fat,HSHF)食物均會促進腫瘤的形成和發展,或升高死亡率[5-7],但在肺腫瘤方面鮮有相關報道。 本項目組前期試驗發現BALB/c 對乙基亞硝脲(ENU)敏感,適于制備原發性肺腫瘤模型,而C57BL/6J 則相反。因此在后續的HSHF 食物對小鼠原發性肺腫瘤的影響研究中,選用不同性別的兩個近交系BALB/c 和C57BL/6J 來進行分析比較。 實驗觀察到HSHF 食物加速了BALB/c 和C57BL/6J 肺腫瘤的發展,這一加速作用存在品系和性別間的差異[8]。

要深入探討HSHF 食物對肺腫瘤演進過程的作用機制,首先就要了解HSHF 食物對正常動物生長代謝的影響。 因此本文就不同食物條件下,實驗對照組BALB/c 和C57BL/6J 部分生長代謝指標的差異化改變進行了比較分析,試圖找出高糖高脂食物與兩個小鼠品系在遺傳和性別上的相關性,為進一步研究HSHF 食物對腫瘤發生發展的作用機制提供對照參考和背景資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

BALB/c 和C57BL/6J 小鼠購自廣州中醫藥大學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0034],SPF 級,4～6 周齡,15～18 g,雌性40 只,雄性15 只,實驗所用動物為其子代,數量見表1。 動物飼養及實驗在廣州醫科大學實驗動物中心[SYXK(粵)2021-0168]完成,均通過廣州醫科大學實驗動物福利倫理委員會審批(2014-068),實驗過程遵循3R 原則。技術人員均具備在該設施中從事動物實驗的資質。

表1 用于樣本采集的小鼠數量Table 1 Numbers of mice used for sample collection

1.2 主要試劑與儀器

Co60輻照滅菌的維持飼料和HSHF 飼料(含200 g/kg 蔗糖和150 g/kg 豬油)由廣東省醫學實驗動物中心提供;飼料組分、動物交配方法及妊娠天數的確定等,筆者前期已進行詳細描述[8];TCHO 試劑盒(140307,上海豐匯);LDL 試劑盒、HDL 試劑盒、TG試劑盒(7021200707、7020200707、7032170614,長春匯力)。 自動組織病理處理器(徠卡,上海,中國);血糖儀(Accu-Chek Active,羅氏,中國);紫外分光光度計(UV-7502 型,上海鑫茂,中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及實驗過程

仔鼠出生后第25 天斷奶,稱重后,按品系、性別隨機分為維持飼料組(標準食物)和HSHF 飼料組(HSHF 食物)分籠飼養,每籠4～5 只。 從斷奶到實驗結束(滿24 周),每兩周測量1 次體重(精確度:0.01 g)。

1.3.2 樣品采集和處理

樣本采集前,小鼠禁食4 h。 稱量最終體重。 麻醉后采血,4℃離心收集血清,按0.5 mL 等份分裝,-80℃保存備用。

1.3.3 標本處理

采血結束時測定血糖,處死小鼠后,解剖收集全肺(包括氣管)、肝和脾樣本,稱量濕重(精確度:0.001 g)。 通過氣管向肺內注入磷酸緩沖福爾馬林后將全肺、整個脾和來自最大肝葉的一塊肝組織放入固定液中,固定24～48 h,按標準程序進行石蠟包埋,5 mm 切片,HE 染色。

1.3.4 血脂指標測定

各組隨機選取5 只小鼠的血清,按照試劑盒的說明程序測量總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。 測量前,將血清置于室溫下,樣品在37℃水浴中孵育10 min(TG、LDL 和HDL)或15 min(TC)后,測定光密度值(OD)并轉換為實際濃度(mmol/L)。

組織病理評估:各組隨機選取3～4 只小鼠肺、脾和肝的病理切片進行評估。

1.3.5 數據分析生長曲線通過每兩周稱量的體重計算。 器官指數是小鼠器官的濕重與其最終體重的比值,反映器官相對于最終體重的比例。 因為這些器官指數均為小數,為便于閱讀和繪圖,將以實際值乘以系數表示。 肺、脾指數所乘系數為1000,肝指數所乘系數為100。

1.3.6 相對比值

為了更直觀地反映HSHF 食物的影響,以便從更多維度體現其變化幅度,本文引入了相對比值的概念,即各指標的HSHF 食物組平均值與標準食物組平均值之比。 例如:相對生長曲線為HSHF 食物組與標準食物組在各觀察時間點的平均體重之比;相對器官指數是兩種食物的器官指數平均值之比;相對血糖值是兩種食物的血糖平均值之比;血脂各指標的相對比值是兩種食物的血脂各指標平均值之比。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件,通過重復測量及方差分析方法,對小鼠性別、品系、食物等因素進行統計分析。 所有數據均以平均數±標準差(±s)表示。 組間比較因是否服從正態分布或方差齊性而相應地采用獨立樣本t檢驗或非參數檢驗Mann-WhitneyUtest;計數資料以絕對數和相對數指標表示,組間比較用χ2檢驗;不同時間的體重變化用重復測量方差分析,固定時間點,按照性別分層,不同品系間的單獨效應分析采用獨立樣本t檢驗。 以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同品系小鼠的生長曲線及HSHF 食物對小鼠生長曲線的影響

圖1 表示不同性別小鼠的生長曲線(圖1A、圖1B)和相對生長曲線(圖1C、圖1D),反映從斷奶到24 周齡不同性別BALB/c 和C57BL/6J 的生長模式。

同一性別的兩個品系,生長曲線存在顯著差異(圖1A、圖1B),HSHF 食物顯著改變了小鼠的基礎生長模式。 兩性品系間生長曲線差異顯著,品系與年齡的交互作用具有統計學意義(雌性F=4.146,P=0.000;雄性F=3.207,P=0.003),即HSHF 食物對小鼠生長曲線的影響具有品系的差異,后經過二次統計學分析,品系的差異僅在雌性中顯著(F=18.869,P=0.000),在雄性中不顯著(F=0.154,P=0.697),在雌、雄小鼠的相對生長曲線圖中看得比較清楚(圖1C、圖1D)。 在HSHF 飼料影響下,雄性小鼠生長曲線的模式在品系間明顯不同(圖1C),而雌性小鼠的生長變化趨勢非常一致(圖1D)。

圖1 高糖高脂(HSHF)食物對小鼠生長曲線的影響( xˉ±s,g)Note. A/B, Growth curve was graphed by the average body weight from weaning to 24 weeks and presented by sex. C/D, Relative growth curvein the female or the male group of BALB/c and C57BL/6J.Figure 1 Effects of the HSHF diet on the growth curve

2.2 不同品系、不同性別小鼠血糖水平及HSHF食物對小鼠血糖升高的影響

在標準食物組,小鼠血糖在品系間(F=38.499,P= 0.000) 和性別間(F= 12.344,P=0.001)間均存在顯著差異(圖2A),且品系與性別的交互作用(品系×性別) 有統計學意義(F=12.160,P=0.001)。 結果表明C57BL/6J 的血糖水平高于BALB/c 的(品系差異),在C57BL/6J,雄性的血糖高于雌性的(性別差異);而在BALB/c,雌性高于雄性的(品系與性別的交互作用),也證實了血糖水平存在品系和性別的差異(圖2A)。

HSHF 食物顯著提高了小鼠的血糖(F=25.481,P=0.000),但是所增加的幅度因品系和性別而有所不同,主要是顯著地增加雄性的血糖,分別為C57BL/6J 雄性1.22 倍,BALB/c 雄性1.24倍,雄性顯著高于雌性的(F=4.674,P=0.033)(圖2B),且性別與食物的交互作用存在顯著相關,意味著HSHF 食物對雄性血糖的影響要顯著大于對雌性的,而且逆轉了BALB/c 品系雌雄性基礎血糖的模式。

圖2 HSHF 食物對血糖水平的影響Note. A, Levels of blood glucose in both strains and sexes. B, Magnitudes of increases in the blood glucose were shown more clearly by the relative increases of blood glucose on the HSHF diet.Figure 2 Effects of the HSHF diet on levels of blood glucose

2.3 品系和性別對血清脂質及HSHF 食物對血脂變化的影響

所測定的血清脂質數值列入表2,表3 則列舉了品系、性別、食物與各血脂指標的統計學分析結果。 在標準食物組,4 個血脂指標存在品系之間或性別之間差異,其中BALB/c 的TG 水平遠高于C57BL/6J 的(表2)。 品系因素在LDL 和TG 中作用顯著,性別因素在HDL、LDL 和TCHO 中作用顯著,似乎只有LDL 同時受到了品系和性別的影響(表3)。

HSHF 食物組與標準食物組的比值直觀地反映了HSHF 食物對血脂水平的影響(如表2 第5～6 行所示)。 與標準食物比,HSHF 食物不同程度地提高了除雌性TG 外的其它血脂指標(表2),其中HDL和TCHO 升高顯著。 HSHF 食物對TG 的影響主要反映在性別與食物以及品系與食物顯著的交互作用(性別×食物;品系×食物,表3),即:HSHF 食物提高了兩個品系雄性的TG,而降低了雌性的TG(表2);HSHF 食物所引起的不同性別小鼠TG 升高或降低的幅度,BALB/c 的均高于C57BL/6J 的(表3)。

表2 血清脂質水平(±s)Table 2 Levels of serum lipids

表2 血清脂質水平(±s)Table 2 Levels of serum lipids

雌性Female 雄性Male食物分組Group of diet品系Strains高密度脂蛋白HDL低密度脂蛋白LDL總膽固醇TCHO甘油三酯TG高密度脂蛋白HDL低密度脂蛋白LDL總膽固醇TCHO甘油三酯TG標準食物Standard diet C57BL/6J 1.540±0.078 0.874±0.204 BALB/c 1.432±0.150 0.494±0.084 1.886±0.225 0.866±0.101 2.010±0.419 0.446±0.097 2.226±0.409 0.322±0.008 1.634±0.135 1.854±0.203 2.002±0.281 0.282±0.036 2.288±0.302 1.430±0.287高糖高脂食物HSHF diet C57BL/6J 2.120±0.333 0.908±0.132 BALB/c 2.374±0.431 0.642±0.075 3.952±0.388 0.864±0.068 3.222±0.453 0.902±0.074 4.950±0.453 0.776±0.239 3.998±1.045 1.586±0.129 3.556±0.350 0.570±0.039 4.376±0.398 1.498±0.124高糖高脂食物/標準食物HSHF diet/standard diet C57BL/6J 1.377 1.300 2.095 0.998 1.063 2.022 2.224 1.039 BALB/c 1.658 2.410 2.447 0.855 1.776 2.021 1.913 1.048

2.4 不同品系的肝指數基礎模式及HSHF 食物引起的肝脂肪變性程度的影響

肝指數在品系間存在顯著差異(F=53.884,P=0.000),而性別間差異不明顯(F= 0.026,P=0.872),換句話說,就是不同的品系肝指數的基礎模式可能不同,在本實驗所應用的C57BL/6J 中,雌、雄性的肝指數幾乎是一致的,而在BALB/c 中,雄性的肝指數值要高于雌性的,盡管沒有統計學差異(圖3A)。

HSHF 食物顯著提高了肝指數(F= 179.897,P=0.000),其中C57BL/6J 雄性和BALB/c 雌性增加幅度較大,而BALB/c 的增加幅度又比C57BL/6J大得多(圖3A),相對肝指數更直觀地反映了其增加幅度(圖3B)。 通過比較品系與食物以及性別與食物之間的交互作用,可以了解到HSHF 食物對肝的影響在品系(F=31.544,P=0.000)和性別(F=4.193,P= 0.043) 間存在顯著差異;品系間,對BALB/c 的影響大于C57BL/6J;性別間,在BALB/c對雌性的影響大于雄性,而在C57BL/6J 則正好相反(圖3A、圖3B)。

組織病理檢查顯示:標準食物組單層肝細胞構成的肝板輻射到終末肝小靜脈,肝竇清晰可見(圖3C)。 HSHF 食物組肝細胞增大,肝竇消失,肝細胞胞漿呈泡沫狀,部分胞漿中出現不同大小的空泡(圖3D),說明HSHF 食物引起了肝的脂肪變性。

總之,小鼠的品系和性別對4 個血脂指標水平起著復雜的決定作用。 HSHF 食物選擇性地顯著提高HDL 和TCHO,并顯著影響特定品系和性別的TG,對LDL 則無明顯影響(表3)。

表3 采用單因素方差分析的血脂統計分析結果Table 3 Statistical results of serum lipids analyzed by univariate analysis of variance

筆者嘗試通過對泡沫狀胞漿肝細胞百分比和空泡狀(忽略大小)胞漿肝細胞數量的半定量評分系統(表4)來評估HSHF 食物引起的肝脂肪化的程度。 該評分系統的實際評估效果良好,通過統計HSHF 食物組中3 或4 只小鼠的平均得分,直觀反映了肝脂肪化的嚴重程度(表5)。 結果顯示:BALB/c 雄性得分最低,即其所受影響最小,脂肪化程度最低。 對應比較顯示,組織病理結果與肝指標及半定量評價結果基本一致。 圖3B 中BALB/c 雄性的相對肝指數較高可能是基于其最終體重相對較輕的原因(圖1B)。

表4 半定量評價肝脂肪改變程度的評分系統Table 4 Scoring criteria to semiquantify the severity of liver fatty changes

表5 HSHF 食物影響肝脂肪變性程度的半定量評價Table 5 Semiquantified severity of fatty changes in the liver on the HSHF diet

總之,食物引起的小鼠肝脂肪化具有品系和性別的特異性。 從組織學上來看,這種特異性主要表現在標志著肝細胞脂肪變性程度的胞漿空泡化肝細胞的數量上。

2.5 不同品系兩性小鼠的脾指數及HSHF 食物對小鼠脾指數的影響

小鼠脾指數在品系(F=26.611,P=0.000)和性別(F= 4.397,P= 0.038) 間存在顯著差異,C57BL/6J 的基礎模式為雌性的脾指數高于雄性的,而BALB/c 的則相反(圖4A)。 HSHF 食物改變了脾指數,但統計分析結果處于臨界狀態(F=3.923,P=0.050),可能與脾指數變化的趨勢不同所致(圖4A),在C57BL/6J 小鼠,脾指數只是略有升高(圖4B),而在BALB/c 小鼠,脾指數明顯縮小,且雄性的縮小要顯著大于雌性的(圖3B),脾指數的基礎模式被改變,這一改變可由品系與食物之間存在的顯著交互作用(F=6.939,P=0.010)證實。

圖3 HSHF 食物對肝的影響Note. A, Average liver index in both sexes of C57BL/6J and BALB/c mice. B, Relative liver index in both sexes of C57BL/6J and BALB/c mice. C, Liver histology on the standard diet. D, Liver histology on the HSHF diet.Figure 3 Effects of the HSHF diet on the liver

圖4 高糖高脂(HSHF)食物對小鼠脾的影響Note. A, Average spleen index. B, Relative changes of the spleen index on the HSHF diet.Figure 4 Effects of the HSHF diet on the spleen

小鼠脾組織病理檢查結果顯示:脾細胞小,白色髓質不明顯。 與標準食物相比,HSHF 食物所引起的組織學或細胞學變化需要更加深入細致的研究,有待進一步探討。

2.6 組織病理觀察HSHF 食物對肺的影響

小鼠肺指數在性別間存在顯著差異(F=18.580,P=0.000),兩個品系的肺指數雌性的均大于雄性的(圖5)。 沒有觀察到品系與食物之間或性別與食物之間的交互作用,雖然HSHF 食物(除BALB/c 雄性外)的肺指數呈下降趨勢,但差異無統計學意義(F=3.079,P=0.082)(圖5A)。

肺組織病理觀察結果顯示,與標準食物相比,HSHF 食物對小鼠肺組織沒有產生任何可觀察到的組織病理變化(圖5B)。

圖5 HSHF 食物對肺的影響Note. A, Lung index in mouse. B, Histology of the lung on the HSHF diet did not show any recognizable morphological changesFigure 5 Effects of the HSHF diet on the lung

3 討論

本研究的不足之處是實驗所用C57BL/6J 仔鼠數量較少,導致BALB/c 和C57BL/6J 數量不均,雖然實驗中增加了C57BL/6J 雌性母鼠的數量,但由于C57BL/6J 仔鼠的存活率較低,所以在有限的實驗時間內C57BL/6J 的后代數量仍較BALB/c 為少,這有可能影響結果分析的質量。 筆者在之前的報道中對這一現象進行了仔細分析[9],一個合理的解釋是,實驗中腹腔注射的酸性磷酸鹽緩沖液可能對孕期和哺乳期的C57BL/6J 影響更大。 考慮到使用的是全同胞兄妹交配的近交系后代,且數量已能滿足統計分析要求,因此筆者認為本實驗中C57BL/6J仔鼠的數量是足以反映真實情況的。

本研究通過對BALB/c 和C57BL/6J 的生長曲線、血糖、血脂、器官指數及器官組織病理等指標進行觀察分析,探討了在標準食物上兩個近交系小鼠的生長代謝模式及其在HSHF 食物上的差異化反應。 結果顯示,每個研究指標幾乎都存在品系間的差異,雖然也觀察到性別對各指標的復雜化影響(血糖和血脂),但這些影響仍需通過品系與性別的交互作用而由品系起最終決定作用,說明BALB/c和C57BL/6J 在遺傳上具有較大差異,而且這些差異直接決定了兩個品系各自的生長代謝模式。HSHF 食物對各指標的影響,也取決于品傳及性別。

盡管存在各自代謝途徑上的差異[10-11],HSHF食物對生長代謝的影響效果可能與高脂食物類似[12],高糖高脂食物中糖的比例較高會加重脂肪的影響效應。 本文實驗中,HSHF 飼料的熱量值為4.4 cal/g,維持飼料為3.4 cal/g[8],從斷奶到24 周齡,連續HSHF 食物,會導致BALB/c 和C57BL/6J 小鼠的肥胖、高血糖、血脂異常和肝脂肪變性[13]等。 有研究描述和討論了動物對高脂食物的不同反應[14-15],與之相比,本研究有4 點新發現:

首先,HSHF 食物對動物生長的影響可能具有性別特異性。 實驗中,只有BALB/c 雄性在經過一個快速生長期后,在每個觀察時間點其生長曲線都只出現了小幅增長(圖1B);血糖(圖2B)和TG(表2)升幅最大;而肝脂肪化程度最低(表5)。 其HDL的增加(表2)表明肝細胞正在努力運輸多余的脂肪到外周組織。 綜合上述結果設想:BALB/c 雄性小鼠可能不能良好地適應HSHF 食物,因此HSHF 飼料的攝入量最少。 表明,對增加的膳食脂肪,不僅不同品系小鼠的反應不同[16],而且不同性別小鼠的反應也不一致。

其次,HSHF 食物對小鼠脾的影響可能也具有品系和性別的特異性。 脾指數(圖4A)在兩個品系之間、在同一品系的兩個性別之間均存在顯著差異。 HSHF 食物提高了C57BL/6J 的脾指數,但降低了BALB/c 的脾指數,但在脾的組織和細胞水平沒有觀察到明顯變化。 由于在類似的研究中很少有關于脾改變的報道,因此HSHF 食物引起兩個品系小鼠脾指數變化的原因還有待進一步研究[17]。BALB/c 雄性對HSHF 飼料的攝入量下降、脾指數卻大幅降低(圖4B)說明在生長發育階段HSHF 食物對這一品系雄性小鼠脾的影響是巨大的,同時也表明HSHF 食物的影響不只局限于代謝系統,也可涉及到更廣泛的系統[12]。

第三,組織病理結果顯示,HSHF 食物對肺的影響是有限的。 整體看來,肺指數有極小幅度的下降,這可能是源于動物最終體重的增長(圖5A)。BALB/c 雄性小鼠肺指數升高,可能是因為其肥胖個體較少、最終體重增長幅度較小所致。 據報道,HSHF 食物可通過影響肺細胞的代謝而影響肺的代謝組分[18];但在本實驗中,與標準食物組相比,HSHF 食物組的HE 染色切片上未觀察到明顯的組織病理改變(圖5B)。

最后,本文建立了一種對肝脂肪變性程度進行有效評估的半定量評分方法(圖3D),將該評分方法與相應的血脂檢測結果進行比照,可以更清晰地解釋HSHF 食物對動物肝代謝的影響。 本文嘗試借助該方法建立一種分析模式,通過比照印證多種相對精準的結果,多方位地對食物影響動物生長代謝的復雜性進行剖析,從而進一步提高數據的可靠性和分析的有效性。

本實驗中小鼠生長代謝結果顯示,遺傳(品系)差異是造成小鼠不同食物環境下生長代謝發生改變的首要原因。 小鼠基因組成確立了其食物誘導肥胖引起生長代謝相關改變的基本模式[19]。 其他因素如性別,將在特定情況下發揮影響作用:在高脂食物作用下,性別是主要的影響因素(78%)[14]。本研究提供了一些證據,表明性別的影響可能依賴于基因。 血糖水平是遺傳決定性狀受性別影響的典型例子(從統計學上看是遺傳與性別交互作用的結果)。 遺傳和性別的交互作用在高脂或HSHF 食物引起的各種疾病中都有報道[20-22]。

綜上所述,HSHF 食物對小鼠生長代謝的影響是復雜的;遺傳是主要的決定因素,性別以性別特異性或遺傳-性別特異性的方式通過遺傳起作用。本研究為食物對動物生長代謝的影響提供了基礎數據和系統分析,同時也為探討HSHF 食物對ENU誘導的肺腫瘤的作用提供了前提和幫助。