對香豆酸誘導彌漫性大B 細胞淋巴瘤細胞內質網應激介導的凋亡

侯著法趙冰潔車 虹易文靜劉培佳劉松山

(成都中醫藥大學附屬醫院血液科,成都 610072)

彌漫性大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人最常見和最具侵襲性的淋巴組織腫瘤之一,占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin Lymphoma,NHL) 病 例 的30% ～ 40%[1]。DLBCL 具有浸潤性生長快、惡性程度高、預后差等特點[2]。 早期淋巴瘤的治愈率約為40%～60%,而晚期淋巴瘤的5 年生存率不到30%,盡管目前標準R-CHOP(利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)治療方案可以提高DLBCL 患者的有效率,但30%～40%的患者對治療無效或治療后復發,這表明標準的細胞毒治療有其局限性[3-4]。 因此,有必要尋找新的治療藥物或治療策略,以有效地提高DLBCL 患者的生存率或延緩其復發。

目前,DLBCL 的治療臨床應用最廣泛的為西藥,中藥是一個全新的選擇,研究報道中醫藥已廣泛應用于癌癥的治療,天然產物/草藥可以為包括DLBCL 在內的多種腫瘤的單一療法或聯合治療提供其他策略[5]。 對香豆酸(p-coumaric acid,p-CA)是白花蛇舌草的主要成分,白花蛇舌草作為一種被廣泛研究的抗腫瘤中草藥,已被證明可以抑制NHL細胞增殖[6]。 此外,研究報道對香豆酸組合物可抑制白血病細胞株Kasumi-1 的增殖,具有抗腫瘤作用[7]。 然而,對香豆酸對DLBCL 的作用尚不清楚。研究顯示葡萄糖調節蛋白(GRP78)的誘導和未折疊蛋白反應(UPR)的激活在致癌性進展中起著關鍵作用,因此,可以利用癌細胞對這些UPR 信號通路的生存依賴性增加來進行抗癌研究[8]。 基于此,本研究擬探討對香豆酸對DLBCL 的作用,并初步探討其作用機制,以期為DLBCL 的治療提供潛在方法。

1 材料和方法

1.1 細胞

彌漫大B 細胞淋巴瘤OCI-LY1 細胞(批號:BFN60808875)購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

對香豆酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)購自Sigma;CCK8 試劑、細胞凋亡檢測試劑購自上海碧云天生物技術有限公司;Annexin V/PI 凋亡試劑盒購自美國BD 公司;GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 抗體及β-actin 抗體均購自英國Abcam 公司;Western blot 細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 發光試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。 低溫高速離心機購自湖南湘儀集團;流式細胞儀購自美國BD 公司;電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司;Bio-Rad 全功能成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK8 法檢測細胞增殖

用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基培養細胞,置于37℃、5% CO2、95%濕度培養箱中培養,隔天換液,傳代1 次,取對數生長期的細胞用于后續實驗。

取對數生長期細胞,按照5×103個/孔的細胞量將細胞接種于96 孔板中,置于37℃、5% CO2、95%濕度培養箱中培養24 h,分組加入不同濃度對香豆酸(0、0.4、0.8、1.6、3.2 mmol/L),每個樣本設6 個平行孔,繼續培養24 h。 隨后,每孔加入10 μL CCK8 溶液,37℃繼續培養2 h,通過酶標儀測量450 nm 處的光密度值(OD)來評估細胞增殖情況。 抑制率(%)=[1-(OD 實驗組-OD 空白組)/(OD 對照組-OD 空白組)]×100%,計算對香豆酸IC50進行后續實驗。

1.3.2 Annexin V/PI 雙染檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞,按照5×105個細胞/皿的密度接種細胞至60 mm 培養皿中,培養24 h 后設置分組為:(1)空白對照組、對香豆酸(1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組);(2)空白對照組、對香豆酸IC50、4-PBA 組(5 mmol/L)、IC50+4-PBA 組。 按組別分別加入對香豆酸或4-PBA。 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒檢測細胞凋亡,將細胞用冰冷磷酸鹽緩沖鹽水洗滌后,用含有Annexin V 和PI 的結合緩沖液在室溫黑暗環境中孵育15 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡并分析各組細胞凋亡率。

1.3.3 Western blot 檢測GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達

設置分組:(1)空白對照組、對香豆酸(1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組);(2)空白對照組、對香豆酸IC50、4-PBA 組(5 mmol/L)、IC50+4-PBA 組,按組別分別干預。 24 h 后收集細胞并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解,BCA 試劑盒測量細胞裂解物中的蛋白質濃度,經10% SDS-PAGE 電泳后,將分離出的蛋白質轉移到PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶室溫孵育1 h 后,分別與GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α(1 ∶500)或β-actin(1 ∶1000)一抗在4℃下孵育過夜,再與辣根過氧化物酶偶聯二抗在室溫下孵育2 h。 ECL 試劑盒檢測免疫反應條帶,使用Bio-Rad 全功能成像系統采集圖像,Image-ProPlus 分析光密度,以β-actin 為內參,對照組目標蛋白質相對含量為1,計算各組蛋白質的相對表達量,實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

運用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間均數的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對香豆酸對OCI-LY1 細胞增殖的影響

對香豆酸以劑量依賴性方式抑制OCI-LY1 細胞的增殖,對香豆酸對OCI-LY1 細胞的IC50值為2.601 mmol/L(圖1)。

圖1 對香豆酸對OCI-LY1 細胞增殖的影響Figure 1 Effect of p-coumaric acid on the proliferation of OCI-LY1 cells

2.2 對香豆酸對OCI-LY1 細胞凋亡的影響

與空白對照組相比,對香豆酸1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組細胞凋亡明顯增加(P<0.01),且呈現劑量依賴性(圖2)。

圖2 對香豆酸對OCI-LY1 細胞凋亡的影響Note. Compared with control group,**P<0.01.Figure 2 Effect of p-coumaric acid on apoptosis of OCI-LY1 cells

2.3 對香豆酸對OCI-LY1 細胞內質網應激相關蛋白表達的影響

與空白對照組相比,對香豆酸1/2 IC50組、IC50組、2 IC50組GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α蛋白表達明顯升高(P<0.01)(圖3)。

圖3 對香豆酸對OCI-LY1 細胞內質網應激相關蛋白表達的影響Note. Compared with control group,**P<0.01.Figure 3 Effect of p-coumaric acid on the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in OCI-LY1 cells

2.4 抑制內質網應激對對香豆酸作用OCI-LY1 細胞的影響

流式細胞凋亡結果顯示,與空白對照組相比,IC50組、IC50+4-PBA 組細胞凋亡明顯升高,4-PBA組細胞凋亡明顯降低(P<0.05);與IC50組相比,4-PBA 組、IC50+4-PBA 組細胞凋亡明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,IC50+4-PBA 組細胞凋亡明顯升高(P<0.05)(圖4A、圖4C)。 CCK8 檢測結果顯示,與空白對照組相比,IC50組、IC50+4-PBA 組細胞抑制率明顯升高(P<0.01);與IC50組相比,4-PBA 組、IC50+4-PBA 組細胞抑制率明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,IC50+4-PBA 組細胞抑制率明顯升高(P<0.01)(圖4B)。 Western blot 檢測結果顯示,與空白對照組相比,IC50組、4-PBA+IC50組細胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯升高,4-PBA 組細胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯降低(P<0.01);與IC50組相比,4-PBA 組、4-PBA+IC50組細胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯降低(P<0.01);與4-PBA 組相比,4-PBA+IC50組細胞GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯升高(P<0.01)(圖4D)。

圖4 抑制內質網應激對對香豆酸作用OCI-LY1 細胞的影響Note. Compared with control group,**P<0.01. Compared with IC50 group,##P<0.01. Compared with 4-PBA group,ΔΔP<0.01.Figure 4 Effects of endoplasmic reticulum stress inhibition on p-coumaric acid-acting OCI-LY1 cells

3 討論

DLBCL 患者預后較差,雖然應用R-CHOP 治療方案可以進一步提高化療效果,但近40%的患者會出現復發/難治性問題[4]。 因此,迫切需要有效的新治療方法和/或新藥來改善治療結果。 對香豆酸作為白花蛇舌草的主要成分之一,對香豆酸可通過調節某些microRNA 的表達在SNU-16 胃癌細胞中發揮其抗癌作用[9]。 可通過激活PERK-eIF2α-ATF-4-CHOP 通路抑制結腸癌細胞Grp78 上調進而誘導細胞凋亡[10]。 此外,對香豆酸可通過改善1,2-二甲基肼給藥大鼠結腸的解毒和凋亡過程來抑制息肉的形成[11]。 然而,對香豆酸在DLBCL 中的作用尚未得到深入研究。 由此,本研究以OCI-LY1 細胞為研究對象,探討了對香豆酸對OCI-LY1 細胞凋亡的誘導作用及機制。

研究已表明成功的抗癌治療涉及有效和特異的腫瘤細胞死亡[12]。 在本研究中,對香豆酸誘導了惡性OCI-LY1 細胞的凋亡,且呈現劑量依賴性方式降低其存活率。 表明對香豆酸對OCI-LY1 細胞凋亡具有促進作用。 研究顯示腫瘤細胞中內質網應激機制決定細胞的命運,在包括淋巴瘤在內的大多數腫瘤中參與細胞凋亡[13]。 在正常情況下,內質網應激結合的傳感器,即PERK、IRE1α 和ATF6 通過GRP78 的關聯而保持在非激活狀態;在內質網應激條件下,GRP78 從傳感器上解離,未折疊蛋白反應被激活,游離的GRP78 作為伴侶幫助新合成的蛋白質實現正確的折疊[14-15]。 此外,PERK 激活導致eIF2a 磷酸化,阻止大部分蛋白質的翻譯,但持續的PERK 信號上調轉錄因子CHOP,從而誘導DNA 損傷蛋白,下調生存期蛋白(Bcl2)[16]。 最后,ATF6 轉位到高爾基體,在那里它的胞漿片段(ATF6f)控制內質網應激相關的降解基因[17]。 在本研究中,我們研究了GRP78 及其下游靶點在對香豆酸干預的OCI-LY1 細胞中的表達,結果顯示對香豆酸干預的OCI-LY1 細 胞 中GRP78、ATF6、 CHOP、 p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯升高,說明對香豆酸通過誘導長時間的內質網應激來抑制適應性反應。 本研究得到了先前研究的證實,這些研究報道了某些化合物,如蝴蝶苷B(Oroxin B)、EHMT2 抑制劑Bix-01294 等,能夠誘導B 淋巴瘤細胞抑瘤性內質網應激,從而導致細胞凋亡[18-19]。 為了進一步明確對香豆酸是否通過內質網應激影響OCI-LY1 細胞凋亡,本研究采用內質網應激抑制劑4-PBA 作用細胞,結果顯示,與對香豆酸 IC50組相比,4-PBA 組、4-PBA+IC50組細胞凋亡及GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯降低,但相比4-PBA 組,4-PBA+IC50組細胞凋亡及GRP78、ATF6、CHOP、p-PERK、p-IRE1α 蛋白表達明顯升高。 提示對香豆酸誘導的細胞凋亡是由內質網應激介導的,內質網應激進一步誘導了下游的凋亡信號。

綜上所述,本研究表明對香豆酸可能激活了內質網應激信號,進而誘導OCI-LY1 細胞凋亡,是一種有效的治療DLBCL 的潛在預防藥物,對提高DLBCL 的治療效果具有重要的藥用價值。