L-乳酸對創傷性顱腦損傷后缺氧誘導因子-1α和突觸可塑性相關蛋白的影響*

趙博，張振，李金英

（1.大連市中心醫院 麻醉科，遼寧 大連 116023；2.煙臺毓璜頂醫院 麻醉科，山東 煙臺 264000）

創傷性顱腦損傷可引起腦缺氧缺血[1-2]，腦血流不足和缺氧導致葡萄糖能量代謝異常，使軸突完整性和突觸可塑性受損[3-5]。在腦缺血和缺氧期間，缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的表達上調，可增加腦組織對缺氧的耐受性[6]。乳酸是糖酵解的產物，作為腦的能量底物參與線粒體呼吸。有研究證明L-乳酸參與神經細胞的能量代謝過程，在腦內L-乳酸可以由星形膠質細胞釋放，并且在大腦能量需求增加時作為重要的能源供應給鄰近的神經元，使神經元可以利用乳酸產生三磷酸腺苷[7-9]。另外，除了來源于星形膠質細胞的乳酸參與大腦的代謝，血漿中的乳酸也可能起著重要的作用[10-11]。顱腦損傷后腦內乳酸濃度顯著升高，增加的乳酸既可以作為大腦能量來源，也可以作為信號分子，改善創傷性顱腦損傷大鼠的神經功能[6，12-14]。有研究[13，15]表明，中至重度腦損傷患者靜脈輸注高滲乳酸鈉可以改善顱腦損傷后的能量代謝。然而，HIF-1α 和突觸可塑性相關蛋白是否參與L-乳酸對創傷性腦損傷的神經保護作用尚不清楚。本研究旨在探討L-乳酸對顱腦損傷后HIF-1α 及突觸可塑性相關蛋白——突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein-95,PSD-95）和生長相關蛋白43（growth associated protein-43,GAP-43）表達的影響，闡明L-乳酸對顱腦損傷的神經保護作用機制，為顱腦損傷的治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

健康成年雄性SD 大鼠27 只，體重250～300 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號SCXK：[遼] 2004-0017，動物實驗許可證號SYXK：[遼] 2004-0029）。大鼠在SPF 環境中飼養，室溫（22±1）℃，24 h 晝夜循環光照，自由進食水。神經細胞株PC12 細胞系（江蘇凱基生物技術股份有限公司）來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，培養于37℃、5%二氧化碳孵育箱中，使用10% FBS 的完全高糖DMEM 培養基。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 L-乳酸（批號：30108518，國藥集團化學試劑有限公司），TRZol、TransScript Top Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司），全蛋白提取試劑盒KGP250/KGP2100、BCA 蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），兔抗鼠HIF-1α（1∶500）、兔抗鼠PSD-95（1∶1 000）、兔抗鼠GAP-43（1∶1 000）（北京博奧森生物技術有限公司），小鼠抗鼠GAPDH 抗體（1∶5 000）、Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG（1∶100）（武漢三鷹生物技術有限公司），DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2.2 主要儀器 自由落體打擊器（北京眾實迪創科技發展有限責任公司），冷凍切片機LEICACM1850、電子顯微鏡（美國Leica 公司），超凈工作臺（北京哈爾儀器制造有限公司），二氧化碳孵育箱（美國Thermo 公司），基因擴增儀ETC811（東勝創新生物科技有限公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型復制及給藥 采用隨機數字表法將實驗大鼠分為3 組：假手術組（Sham 組）、創傷性顱腦損傷組（顱腦損傷組）和顱腦損傷+L-乳酸組（顱腦損傷+Lac 組），每組9 只。采用Fenney’s 自由落體打擊模型[14，16]復制大鼠中度創傷性顱腦損傷模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg 麻醉后，固定于立體定向框架內。在無菌條件下，用牙科鉆于左側頂骨行開顱術（后顱3.5 mm，側顱2.5 mm，直徑5 mm），避免損傷硬腦膜。將一根直徑為4.5 mm、端部扁平的鋼棒（20 g）從25 cm 的高處落在硬腦膜上的活塞上，將腦組織壓縮到大約2 mm的深度，立即更換骨瓣并封閉，縫合頭皮。Sham 組大鼠在相同位置行開顱術，但不撞擊。顱腦損傷大鼠模型通過可見的肢體痙攣、短暫性呼吸暫停和無意識來驗證是否復制成功[17]。待模型大鼠清醒后，采用改良大鼠神經功能缺損評分（mNSS）[18]從運動試驗、感覺試驗、反射喪失和不正常運動及癲病、肌陣攣、肌張力障礙4 個方面進行評分，并確保模型大鼠顱腦損傷程度為中度損傷。參照前期研究[9]，顱腦損傷+Lac 組于顱腦損傷后腹腔注射L-乳酸500 mg/kg，1 次/d，連續7 d；Sham 組和顱腦損傷組腹腔注射等容量生理鹽水，1 次/d，連續7 d。

1.3.2 細胞模型制備及給藥 實驗細胞分為對照組、機械劃痕細胞模型組（MSC 組）和機械劃痕細胞+L-乳酸組（MSC+Lac 組）。參照文獻[19]制備中等機械劃痕細胞模型。PC12 細胞接種于6 孔板上，兩孔為一組。在超凈工作臺內，MSC 組和MSC+Lac組直視下用200 μL 黃色移液管進行縱橫切割損傷細胞，使損傷程度和范圍基本保持一致；參照文獻[19]進行預實驗（時間梯度實驗和濃度梯度實驗），確定MSC+Lac 組L-乳酸濃度20 mmol/L 為最佳治療濃度，處理時間20 min 為最佳治療時間。對照組細胞不做切割損傷。對照組和MSC 組給予相同劑量的0.9%無菌生理鹽水。

1.3.3 大鼠行為學觀察及評分 7 d 后，采用mNSS評分[18]評估各組大鼠神經功能缺損恢復程度。

1.3.4 Western blotting檢測大鼠損傷側皮層、海馬中HIF-1α、PSD-95 和GAP-43 蛋白的相對表達量 行為學觀察結束后，每組隨機取3 只大鼠麻醉后斷頭處死，取其損傷側皮層及海馬組織。將各組腦組織裂解提取總蛋白，用BCA 標準蛋白定量法測定蛋白濃度，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。采用SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜。使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后分別加入兔抗鼠HIF-1α（1∶500）、兔抗鼠PSD-95（1∶1 000）、GAP-43（1∶1 000）及小鼠抗鼠GAPDH 抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜。然后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠IgG 二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h。洗膜后進行化學發光顯影，使用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH 條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達量。

1.3.5 Western blotting 檢測PC12 細胞中HIF-1α、PSD-95 和GAP-43 蛋白的相對表達量 將各組細胞裂解提取總蛋白，用BCA 標準蛋白定量法測定蛋白濃度，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。采用SDSPAGE 凝膠電泳、轉膜。使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后分別加入兔抗鼠HIF-1α（1∶500）、兔抗鼠PSD-95（1∶1 000）、GAP-43（1∶1 000）及小鼠抗鼠GAPDH 抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜。然后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠IgG 二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h。洗膜后進行化學發光顯影，使用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH 條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 qRT-PCR 檢測損傷側皮層HIF-1α mRNA相對表達量 行為學觀察結束后，每組隨機取3 只大鼠麻醉后斷頭處死，取損傷側皮層組織。用TRIZol 試劑提取總RNA，測定RNA 純度和濃度。總RNA 用TranScript Top Green qPCR Kit 逆轉錄成cDNA，合成的cDNA 立即用于定量PCR。HIF-1α 正向引物：5'-TCTAGTGAACAGGATGGAATGGAG-3'，長度24 bp；反向引物：5'-TCGTAACTGGTCAGCTGT GGTAA-3'，長度：23 bp。GAPDH 正向引物：5'-ATG CCGCCTGGAGAAACC-3'，長度18 bp；反向引物：5'-GCATCAAAGGTGGAAGAATGG-3'，長 度：21 bp。擴增條件：第一步94℃30 s；第二步94℃5 s、55℃15 s、72℃10 s，40 個循環；第三步添加熔解曲線，進行qRT-PCR，得到Ct 值。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算大鼠損傷側皮層HIF-1α mRNA 的相對表達量。

1.3.7 免疫熒光染色檢測大鼠損傷側皮質和海馬PSD-95 的熒光強度 行為學觀察結束后，每組隨機取3 只大鼠麻醉后，4%多聚甲醛經心臟灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，蔗糖梯度脫水，濃度依次是10%、20%、30%、30%，使用OCT 包埋劑將脫水完全的腦組織放入-80℃冰箱保存備用。使用冷凍切片機將包埋好的腦組織切成10 μm 厚的切片，放入-80℃冰箱保存備用。將冷凍組織切片取出，37℃烘箱烘片后，使用4%多聚甲醛固定，使用0.2% Triton X-100 通透，滴加3% BSA-PBS 封閉。敷一抗，兔抗PSD-95（1∶100），敷二抗，Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG（1∶100）。細胞核使用DAPI 染色，熒光顯微鏡下觀察。Image J 軟件分析損傷側皮質和海馬CA1 區PSD-95的平均光密度值（靶蛋白的光密度值/受試大腦區域的總面積），統計PSD-95 熒光強度。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠mNSS評分的比較

Sham 組mNSS 評分為（0.67±0.71），顱腦損傷組mNSS 評分為（8.00±1.58），顱腦損傷+Lac 組mNSS 評分為（4.89±0.78）。3 組大鼠mNSS 評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，與Sham 組比較，顱腦損傷組mNSS 評分升高（P<0.01），與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組mNSS 評分降低（P<0.01）。

2.2 3 組大鼠損傷側皮層、海馬中HIF-1α 蛋白、mRNA相對表達量比較

3 組大鼠損傷側皮層、海馬中HIF-1α 蛋白和mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，與Sham 組比較，顱腦損傷組損傷側皮層、海馬中HIF-1α 蛋白和mRNA 相對表達量降低（P<0.05）；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組損傷側皮層、海馬中HIF-1α 蛋白和mRNA 相對表達量增加（P<0.05）。見圖1和表1。

表1 3組大鼠損傷側皮層、海馬中HIF-1α蛋白和mRNA表達比較（n=9，）

表1 3組大鼠損傷側皮層、海馬中HIF-1α蛋白和mRNA表達比較（n=9，）

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與顱腦損傷組比較，P<0.05。

2.3 3組細胞中HIF-1α蛋白相對表達量比較

3 組細胞中HIF-1α 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，與對照組比較，MSC 組HIF-1α 蛋白相對表達量降低（P<0.05）；與MSC 組比較，MSC+Lac組HIF-1α 蛋白相對表達量增加（P<0.05）。見圖1和表2。

表2 3組細胞中HIF-1α蛋白相對表達量比較（）

表2 3組細胞中HIF-1α蛋白相對表達量比較（）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與MSC組比較，P<0.05。

圖1 HIF-1α蛋白表達

2.4 3 組大鼠突觸可塑性相關蛋白相對表達量和免疫熒光強度比較

3 組大鼠損傷側皮層、海馬中PSD-95 和GAP-43 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與Sham 組比較，顱腦損傷組PSD-95 和GAP-43 蛋白相對表達量明顯降低（P<0.01）；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組PSD95 和GAP43 蛋白相對表達量增加（P<0.05）。見圖2、3 和表3。

圖2 3組大鼠損傷側皮層中PSD-95和GAP-43蛋白的表達

圖3 3組大鼠損傷側海馬中PSD-95和GAP-43蛋白的表達

表3 3組大鼠損傷側皮層、海馬中PSD95和GAP43蛋白相對表達量比較（）

表3 3組大鼠損傷側皮層、海馬中PSD95和GAP43蛋白相對表達量比較（）

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與顱腦損傷組比較，P<0.05。

3 組大鼠損傷側皮層和海馬中CA1 區PSD-95熒光強度比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與Sham 組比較，顱腦損傷組PSD-95 熒光強度降低（P<0.05）；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組PSD-95 熒光強度增強（P<0.05）。見圖4 和表4。

表4 3組大鼠損傷側皮層、海馬中PSD-95熒光強度比較（n=9，）

表4 3組大鼠損傷側皮層、海馬中PSD-95熒光強度比較（n=9，）

注：①與Sham組比較，P<0.05；②與顱腦損傷組比較，P<0.05。

圖4 PSD-95免疫熒光圖（×200）

2.5 3組細胞突觸可塑性相關蛋白相對表達量比較

3 組細胞的PSD95 和GAP43 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，MSC 組PSD95 和GAP43 蛋白相對表達量降低（P<0.05），與MSC 組比較，MSC+Lac 組PSD-95 和GAP-43 蛋白相對表達量增加（P<0.05）。見圖5 和表5。

圖5 3組細胞中PSD-95和GAP-43蛋白的表達

表5 3組細胞的PSD95和GAP43蛋白相對表達量比較（）

表5 3組細胞的PSD95和GAP43蛋白相對表達量比較（）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與MSC組比較，P<0.05。

3 討論

Fenney’s 自由落體打擊模型是通過去顱骨手術，將打擊力量作用于完整的硬腦膜引起皮質局灶性腦損傷[16，20]。這些損傷是在幾個小時內直接由挫傷皮層處發生的損傷和壞死腔引起的[16]。本研究采用mNSS 評分評估大鼠神經功能缺損情況，確保模型大鼠損傷程度為中度損傷。本研究結果表明，與Sham 組比較，顱腦損傷組大鼠的mNSS 評分增高，提示顱腦損傷動物模型復制成功。在前期實驗[14]中給予乳酸預適應后能改善顱腦損傷大鼠的神經功能，故本研究參照前期實驗的大鼠給藥劑量和方法，選用乳酸持續治療7 d，進一步驗證在顱腦損傷后持續L-乳酸治療的效果及機制。

本研究制備機械劃痕細胞模型，能有效地模仿腦損傷后神經細胞的病理變化[21]。有研究證明，大腦皮層神經元損傷后30 min，大鼠存活率明顯下降，乳酸脫氫酶明顯增加[22]，使用15～30 mmol/L L-乳酸能保護缺血大鼠海馬星形膠質細胞[23]。本研究使用PC12 細胞系制備中度損傷的機械劃痕細胞模型，通過預實驗確定損傷時間為20 min，L-乳酸濃度為20 mmol/L，處理時間20 min。本研究結果顯示，與對照組比較，損傷20 min 后MSC 組HIF-1α蛋白相對表達量降低；與MSC 組比較，經20 mmol/L L-乳酸處 理20 min 后，HIF-1α 蛋白相 對表達 量增加。

大量研究[24-28]表明，外源性給予乳酸對腦缺血和創傷性腦損傷有保護作用。持續靜脈輸注L-乳酸鈉對嚴重創傷性腦損傷患者有益[13]；在動物實驗中，L-乳酸預處理可減輕創傷性腦損傷[14]。本研究結果表明，與Sham 組比較，顱腦損傷組大鼠的mNSS評分升高；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組大鼠的mNSS 評分降低，提示L-乳酸持續治療7 d后可改善顱腦損傷大鼠的神經功能缺損程度。

HIF-1 是一種異二聚體，由HIF-1β 和HIF-1α組成[29]。研究表明，HIF-1α 可改善缺氧缺血損傷[30-31]。HIF-1α 在顱腦損傷早期表達上調[6]，本研究結果表明，HIF-1α 在腦損傷后第7 天時表達降低，可能是由于顱腦損傷后7 d 大鼠處于失代償狀態導致HIF-1α 表達降低。本研究的動物實驗結果表明，與Sham 組比較，顱腦損傷組HIF-1α 表達降低；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組HIF-1α表達增加。本研究的細胞實驗結果表明，與對照組比較，MSC 組HIF-1α 表達降低；與MSC 組比較，MSC+Lac 組HIF-1α 表達增加。以上結果提示HIF-1α 參與創傷性腦損傷的發生，L-乳酸減輕腦損傷的機制與促進HIF-1α 蛋白和mRNA 表達有關。

突觸可塑性在創傷性腦損傷中嚴重受損[31]，可塑性相關蛋白PSD-95 和GAP-43 減少[31-33]，L-乳酸預處理可促進PSD-95 和GAP-43 表達[14]。有研究表明，激活HIF 信號通路，可促進抑郁大鼠海馬神經發生和突觸可塑性增加[34]。本研究結果進一步表明，在動物實驗中，與Sham 組比較，顱腦損傷組PSD-95 和GAP-43 表達降低；與顱腦損傷組比較，顱腦損傷+Lac 組PSD-95 和GAP-43 表達增加。細胞實驗中，與對照組比較，MSC 組PSD-95 和GAP-43表達降低；與MSC 組比較，MSC+Lac 組PSD-95 和GAP-43 表達增加。以上結果均提示L-乳酸通過激活HIF-1α 進而促進PSD-95 和GAP-43 表達，對創傷性腦損傷神經具有保護作用。

綜上所述，L-乳酸通過上調HIF-1α 表達進而增加突觸可塑性相關蛋白（PSD-95、GAP-43）的表達來減輕大鼠創傷性腦損傷。