超高液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術定量牛奶中主要蛋白質

韓靜雯，李國輝*，鐘其頂，王道兵，班楠，劉洋

1(中國食品發酵工業研究院，北京，100015)2(北京市產品質量監督檢驗院，北京，101300)

牛奶作為日常生活中最常見的乳品，以其較高的蛋白質含量在人們各個成長階段中發揮著重要作用。牛奶蛋白中含量最高的是酪蛋白和乳清蛋白。牛酪蛋白包括β-酪蛋白(β-casein, β-CN)、αS1-酪蛋白(αS1-casein, αS1-CN)、αS2-酪蛋白(αS2-casein, αS2-CN)和κ-酪蛋白(κ-casein, κ-CN)，其中β-CN含量接近40%，且具有遺傳多樣性[1]，其會在被消化后形成較小的酪蛋白磷酸肽，酪蛋白磷酸肽可促進鈣的吸收并與睡眠活動相關[2]。在已經發現的十幾種β-CN的變異體中,最常見的是A1型和A2型。αS-酪蛋白(αS-casein, αS-CN)是牛乳中主要過敏原之一，主要組分為αS1-CN和αS2-CN，對αS-酪蛋白過敏的人群約占乳品過敏總數的65%左右[3]。κ-酪蛋白影響酪蛋白膠束的形成、大小和功能，同時具有抗菌活性、增加消化率等重要的生理學功能[4]。

牛乳清蛋白中主要含有α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-La)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)[5]。α-La能夠為發育中的新生兒提供蛋白質合成所必需的氨基酸，如色氨酸等，在促進嬰兒生長發育的同時，具有免疫調節和促進大腦發育的作用[6]。成年人攝入α-La可以提高個體的認知能力、記憶力和睡眠質量，此外，α-La還是鈣、鎂、錳、鈉、鉀和鋅的載體[7]。β-Lg是牛乳中具有天然防御功能的脂蛋白，經過胃酸和蛋白酶等消化后仍有部分保持完整的蛋白結構，因此也會造成一系列的過敏反應。同時，β-Lg是基本氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，并能夠結合脂溶性維生素，增加其生物利用率[8]。

現在常用于檢測酪蛋白和乳清蛋白主要組分的主要有電泳法[9-10]、酶聯免疫吸附法[11-12]、高效液相色譜[13-15]和液相色譜-質譜聯用法[16-18]等。通常前3種方法的單個樣品檢測需耗費大量時間，而液相色譜與質譜的聯用大大縮短了檢測時間，并一定程度提高了檢測的精確度和靈敏性，使對牛奶中不同蛋白質的定量研究愈加方便準確。

本研究在BOBE等[19]建立的乳蛋白液相色譜測定方法的基礎上優化了對牛奶樣品的前處理方式，確定了有效色譜分離和質譜檢測條件，在實現對牛奶中6種主要蛋白質定量檢測的同時，通過解卷積分析對比觀測質量數與理論質量數，可確認各個蛋白峰中包含的主要蛋白質亞型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標準品：κ-CN，αS-CN，β-CN，α-La，β-Lg，源葉生物公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)、鹽酸胍(GdnHCl)、檸檬酸鈉、dL-二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)，乙腈(acetonitrile,ACN)，Sigma公司；超純水(Milli-Q制備系統)，美國Millipore公司。

1.2 實驗儀器

1290-6546超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀，配備Dual AJS ESI源，美國Agilent公司；離心機，貝克曼庫爾特美國股份有限公司；渦旋振蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司；一次性針管注射器，江蘇治宇醫療器材有限公司；0.22 μm濾膜，北京匯科同創科學儀器有限公司。

1.3 樣品收集

牛奶乳頭奶樣品分別采集于河北省、湖北省、黑龍江省和新疆維吾爾族自治區大型牧場，每個地區各選擇6個樣品，共24個樣品。

1.4 試劑配制

流動相A：0.1%(體積分數，下同)TFA的水溶液；流動相B：0.1%TFA的乙腈溶液。

溶液A：根據定容體積，準確稱(量)不同量的各試劑，使得最終混合溶液中含有17.5 mmol/L Tris Base緩沖液，6 mol/L GdnHCl的溶液，5.37 mmol/L檸檬酸鈉，20 mmol/L DTT，溶液最終pH為7.92；溶液B：含有4.5 mol/L GdnHCl的流動相A，溶液pH為2.25。

1.5 樣品前處理

樣品前處理：1 mL溶液A在室溫下加入到1 mL樣品中，渦旋振蕩10 s，室溫下孵育1 h，之后在4 ℃下16 000×g離心5 min，去除脂肪層。殘留液經溶液B以體積比1∶3稀釋后，0.22 mm濾膜過濾，上樣分析。

標準品前處理：標品蛋白質用超純水溶解，分別配成質量濃度為40 mg/mL κ-CN，40 mg/mL αS-CN，40 mg/mL β-CN，20 mg/mL α-La，20 mg/mL β-Lg的標準儲備溶液，儲存在-20 ℃的冰箱中備用。將配好的標準品等體積混合，配制成混合標樣溶液，之后操作步驟同牛乳樣品預處理。在相同的前處理條件下，用超純水代替樣品制備溶劑作為對照。

1.6 色譜條件

使用安捷倫ZORBAX 300Extend-C18(2.1 mm×100 mm,300 A) 色譜柱，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min；進樣量1 mL。在6 min內使流動相B從30%升至40%，在6.1 min～16 min使流動相B從40%升至44%，后置平衡時間3 min。

1.7 質譜條件

干燥氣溫度200 ℃；干燥氣流速8 L/min；霧化氣壓力30 psi；鞘氣溫度30 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓3 500 V；質量掃描范圍m/z50～3 200；采集速率2 spectra/s。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化

以牛奶為研究對象，進行6種主要蛋白質的定量探究，使用GdnHCl作為變性劑，以打開蛋白質二級結構，使其中的氫鍵與流動相更好結合；使用DTT作為還原劑，用于還原蛋白質中的二硫鍵，并且阻止蛋白質分子內和分子間的二硫鍵生成。利用Tris base在pH 7.5～9.0較強的緩沖能力，以其作為緩沖劑來防止體系pH變化影響DTT的還原效果。

對乳蛋白的色譜分離通常采用水和乙腈作為流動相，在此基礎上進行不同流動相組分、梯度、流速和進樣量的對比，具體條件見表1。

表1 實驗條件優化Table 1 Optimization of experimental conditions

為了減輕TFA對質譜的影響，使用甲酸(formic acid，FA)取代或部分取代TFA，但峰形較差，不能有效分離。TFA作為一種弱離子對試劑，能夠起到改善峰寬和拖尾的問題，因此隨著TFA的濃度逐漸上升，不同蛋白質峰的出峰情況和分離效果都得到改善。但由于TFA與質譜之間存在不兼容的情況，因此方法在得到較好的分離情況后，不再繼續增加TFA的濃度，盡可能減輕對質譜造成的負擔。

同時，實驗對比了3種不同的流動相梯度洗脫程序，分析起始有機相(流動相B)比例與梯度變化速率對分離度的影響。先以20%有機相作為起始比例，發現蛋白質在洗脫程序的后半程(30%～50%，6.1～16 min)被集中洗脫，從而進一步選取蛋白質出峰的有機相比例范圍(30%～50%，0～16 min)作為單線性梯度，此時部分蛋白峰不能實現有效的分離，出現拖尾、重疊、峰形較差的問題。在此基礎上進行調整，采用了有機相比例從30%～40%(0～6 min)以及40%～44%(6.1～16 min)的兩段線性梯度，以較高的有機相比例確保蛋白峰的分離度，同時又降低最終有機相的比例從而加快梯度變化，促進蛋白質的洗脫，使其具有良好的峰形。

方法使用的色譜柱內徑為2.1 mm，在其適用流速的基礎上，分析了0.2和0.3 mL/min的流速條件對峰型和分離度的影響，發現在0.3 mL/min的流速下，峰形相對較好、峰寬變小，但對于分離度不具有顯著的影響。對進樣量的優化結果顯示，隨著進樣量的增加，峰高增加，但過大的進樣量會使部分峰的分離效果變差、峰寬增加甚至可能出現色譜柱過載的問題，因此選擇進樣量1.0 mL，在保障良好的峰高和響應值的基礎上確保良好的峰寬。基于以上研究，可在16 min內完成單個樣品采集，如圖1所示。

圖1 牛奶中6種主要乳蛋白的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of six main proteins in milk

2.2 牛奶蛋白的定量

2.2.1 標準曲線建立

以超純水為空白基質制作標準溶液，按照同樣的樣品前處理方法，在同一色譜及質譜條件下進行測定。以響應值與濃度建立6種蛋白質分別的標準曲線，結果見表2，各個蛋白質的線性相關系數r均在0.99以上，線性關系良好。

2.2.2 回收率、精密度、檢出限和定量限

對牛奶樣品進行6種蛋白質的3個水平加標回收率的檢測驗證，在各個水平重復3次，計算各個蛋白質分別在3個水平下的回收率以及平均回收率。如表3所示，牛奶蛋白質的平均加標回收率在92%～108%。

表2 六種蛋白質的標準曲線圖Table 2 Standard curve of six proteins in milk samples

表3 六種蛋白質在牛奶樣品里的加標回收率Table 3 Recoveries of six proteins in milk samples

為了驗證方法重現性和重復性，使用樣品溶液按照研究方法進行6次重復檢測，連續6 d，最終結果見表4。最終得到保留時間和峰面積的日內精密度和日間精密度均在10%以下。以標準曲線的最小濃度水平計算方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，分別介于0.027 8～0.268 8 mg/mL和0.092 7～0.896 0 mg/mL。

表4 六種蛋白質在牛奶樣品里的精密度、檢出限和定量限Table 4 RSD, LOD and LOQ of six proteins in milk samples

續表4

2.2.3 牛奶蛋白定量

在此基礎上對來源于不同地區的牛奶樣品進行定量，6種主要蛋白質的平均含量見表5。盡管所有牛奶均來源于荷斯坦奶牛，但κ-CN，αS1-CN和β-Lg的含量沒有顯著差異，但4個不同省份牛奶樣品之間的α-La含量的差異顯著， αS2-CN和β-CN在不同地理環境下呈現極顯著差異。本次研究4個采樣省份中，僅有湖北省來自中國南方地區，與其他3個省份的地理環境差異較大，蛋白含量整體較高。中國土地廣闊，氣候條件以及牧草差異會對奶牛所產牛奶中蛋白質組分含量造成不同程度影響，南北方氣候差異較大，南方規模化養殖場較北方更多。同時，不同氣候條件下，奶牛的進食量差異也會引起奶蛋白含量的差異[20]。因此即便相同奶牛品種，通過對比不同地區的牛奶中主要蛋白質的整體和細化分類含量差異，可以為牛奶產地鑒別提供基礎。將本實驗牛奶蛋白定量結果與文獻[21]中的羊奶和牦牛奶中相應蛋白質含量進行了比較，發現牛奶中的αS-CN和β-Lg均高于羊奶中平均水平，但低于牦牛奶中平均水平。α-La在3種奶中含量相差不大，κ-CN和β-CN的含量均低于羊奶和牦牛奶。據此分析可知，不同氣候條件對牛奶蛋白質含量有顯著影響，物種對乳蛋白質含量影響更為顯著。與此同時，可看出牛奶相較于羊奶和牦牛奶潛在的過敏風險較高，營養價值可能存在一定的差異性。

表5 六種蛋白質在牛奶樣品里的定量結果Table 5 Quantification results of six proteins in milk samples

2.3 牛奶蛋白亞型

利用安捷倫Bioconfirm software對各個蛋白峰進行解卷積，得到觀測質量數，并與文獻[19, 22]中記載的理論質量數進行比對，確認6種蛋白質的主要亞型(圖1)。色譜圖中從左到右依次為κ-CN, αS2-CN, αS1-CN, β-CN, α-La和β-Lg。在此基礎上對各個峰進行解析，各峰的質譜圖和接卷積圖詳見電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.030460 )，分析結果見表6，κ-CN的亞型主要為A型和B型，質量數在19 000～22 000 Da，誤差最大達到了1.95 Da；αS2-CN的主要亞型僅觀測到A型，質量數在25 000 Da以上；αS1-CN的亞型僅觀測到B型為23 614.54 Da；而β-CN的觀測質量數集中在24 000 Da左右，亞型較多，分別為A1型、A2型和B型；B型是此次α-La觀測到的唯一亞型，質量數最低，僅為14 185.72 Da；β-Lg得到2個亞型A型和B型，質量數則高于18 000 Da。事實上，對于蛋白質亞型的檢測既需要有效的前處理過程和分離檢測程序，專業的軟件和數據庫也不可或缺。本次研究簡要對各個蛋白質的主要亞型進行了分析對比，發現同一蛋白質存在不同亞型，若進一步進行分離純化可對不同亞型進行分離，以滿足不同的實驗需求。近些年來，研究者們的關注點從牛奶的蛋白總量轉變成為關注更加細致的蛋白分類和蛋白質亞型含量，以此來進一步明確牛奶的營養價值和致敏性，如部分研究者在針對A1與A2型β-CN的差異時發現，A2型較A1型而言可以在一定程度上緩解乳糖不耐受反應[23]。因此，對于蛋白質不同亞型的檢測分析能夠有利于進一步明確牛奶中蛋白質的主要構成和生理功能。

表6 主要蛋白峰解卷積后的觀測質量數和理論質量數對比Table 6 Comparison of observed mass number and theoretical mass number after deconvolution of main protein peaks

同時，同一蛋白質亞型存在不同觀測質量數并能有相應的理論質量數與之匹配，這是由于蛋白質會與不同數量的磷酸基團結合導致磷酸化，而不同數量的磷酸基團使得質量數產生變化。此外，κ-CN除磷酸化之外還會出現糖基化現象，使得蛋白質質量數出現更多種可能性。

3 結論與討論

本研究方法可在16 min內完成牛奶中6種主要蛋白質定量分析，并通過優化得到較好的峰分離效果。相較而言，電泳法在靈敏度和精確性上較差，易受到雜質干擾；酶聯免疫法靈敏性與特異性高，但卻存在制備新抗體較為繁瑣的問題，通常應用于某一類蛋白質的檢測分析，而不對亞型進行探究；液相色譜法重現性好，能在一定程度上對部分蛋白質亞型進行分離檢測，但耗時較長。本方法的單樣品檢測時長與檢測靈敏度均優于其他3種檢測方法，實現了較短時間的牛奶蛋白質定量，適合進行大批量樣品的采集，方法回收率以及精密度較高，能夠進一步對蛋白質進行更加細致的分析，得到更加豐富的蛋白質亞型信息。本次研究的24個牛奶樣品雖然來自于4個不同的省份，但在6種主要蛋白質的含量上并沒有出現較大的差異，可能與奶牛品種均為荷斯坦奶牛有關，因此若加大采樣數量并進行不同種類奶牛蛋白質比例對比分析，可一定程度上作為奶源分析的基礎。根據采集到的譜圖，針對不同蛋白質峰進行解卷積，探究其更加細化的分類，通過與理論數值進行對比，進一步明確了各個蛋白質在樣品中的主要亞型，可以作為進一步細化牛奶蛋白甚至其他種類乳制品蛋白質種類的依據和對照，方法有望應用于乳制品品質評價與品種鑒別。