食品中檸檬黃快速檢測方法研究進展

石媚，邙明哲，沈辰諭，姚志軼

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，食品質量與安全北京實驗室，北京，100083)

檸檬黃，又稱酒石黃、酸性淡黃、肼黃，化學名稱為1-(4′-磺酸基苯基)-3-羧基-4-(4′-磺酸苯基偶氮基)-5-吡唑啉酮三鈉鹽，是由對氨基苯磺酸經重氮化，與1-(4′-磺基苯基)-3-羧基-5-吡唑啉酮在堿性溶液中偶合、精制而成，屬于水溶性偶氮類色素。由于檸檬黃成本低廉，具有鮮艷的嫩黃色，因此在冰淇淋、雪糕、罐頭、蜜餞、果凍、糕點、飲料、風味發酵乳、糖果等熱銷食品中廣泛應用，是最常用的食品合成色素之一。

然而，隨著毒理學研究的深入，發現檸檬黃可以被腸道菌群代謝產生的偶氮還原酶還原產生芳香胺(磺胺酸)，產生的芳香胺再被 P450 酶氧化為N-羥基衍生物[1]。因此，過量攝入添加了檸檬黃的食品容易使兒童生長發育遲緩、睡眠障礙和神經系統受損，進而引起兒童多動癥、智力下降。此外，研究發現過量攝入檸檬黃還會導致過敏、腹瀉、濕疹、哮喘、頭痛、腎臟功能異常、生殖毒性、先天免疫障礙、神經焦慮、腸道微生物群失衡等癥狀，甚至存在致畸、致癌的風險[2-4]。高劑量的檸檬黃還會與其他著色劑、防腐劑等食品添加劑發揮協同作用，從而表現聯合毒性，如 DNA斷裂損傷、抑制細胞增殖、神經系統發育遲緩等，嚴重危害人體健康[5-7]。2008年的“窩窩頭”事件和2011年的“染色饅頭”事件就是由于檸檬黃的非法添加而引發的食品安全事件。雖然我國在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中對檸檬黃允許使用的食品類別和最大用量上做出了嚴格控制(表1)，然而根據國家市場監督管理總局發布的2020年市場監管部門食品安全監督抽檢情況通告，超范圍超限量使用食品添加劑問題占不合格樣品總量的16.17%。

表1 國家標準規定檸檬黃在部分食品中的最大使用量示例Table 1 The maximum usage of tartrazine in partial classifications of food according to GB 2760—2014

檸檬黃作為重要的食品添加劑之一，價格低廉、穩定性好、著色效果顯著，因此不法商家違規使用檸檬黃的現象屢禁不止，山西左權縣市場監督管理局發布的2020年第2期食品安全監督抽檢信息、貴州省市場監管局網站發布的《關于2批次食品不合格情況的通告(2020年第8期)》、廣東省市場監督管理局網站發布的關于22批次食品不合格情況的通告(2021年第21期)、深圳市市場監督管理局公布的2021年第14期食品安全抽樣檢驗情況等均存在因違規使用檸檬黃而不合格的食品，具體表現為果脯中超量添加、面制品中超范圍添加檸檬黃等[8]。表1列出了檸檬黃在部分食品中的最大使用量，并作為快速檢測方法的依據。

1 概述

傳統的檸檬黃檢測方法包括紫外-可見光分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法等，這些方法大多存在設備昂貴、操作復雜、耗時長、對操作人員要求高等問題。而快速檢測法成本低廉、響應迅速，分析操作過程簡便、對操作人員要求低、方便攜帶，適合于大批量樣品檢測和實時檢測[9-11]。因此，建立檸檬黃的快速檢測方法對于保障相關食品的質量與安全具有重要意義。本文旨在對檸檬黃的快速檢測方法進行綜述，通過分析總結各種檢測方法在食品和藥品中的優缺點、靈敏度以及檢測限等，以期為建立精準快速測定各種體系中檸檬黃含量的方法提供參考。

2 檸檬黃快速檢測方法

2.1 電化學法

程昊等[15]以阿拉伯糖為碳源、孔硅為模板劑制備介孔碳修飾電極，檸檬黃檢測線性范圍為5.34×10-4～5.34 mg/kg，檢出限為0.142 μg。將該傳感器用于檢測螺螄粉腐竹中的檸檬黃，樣品加標回收率為97.38%～104.45%，電極活性位點更多，對檸檬黃的吸附富集作用更強，靈敏度高，穩定性強。林素英等[16]用L-Tyr、金、多壁碳納米管對玻碳電極進行修飾，檢測線性范圍為0.48～26.72 mg/kg，檢出限為0.11 mg/kg。該傳感器的靈敏度高，選擇性和穩定性良好。NAGLES等[17]利用La2O3和 TiO2對碳糊電極進行修飾，并對食品中含有的檸檬黃等色素進行檢測，該法通過La2O3和TiO2組合對電極的積累效應從而達到與石墨烯和TiO2組合相同的效果，降低成本。結果表明，檢測限低于48 μg/kg，該法操作簡便、靈敏度高、經濟環保，應用范圍非常廣泛。AKKAPINYO等[18]用還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide, rGO)、蛋氨酸對絲網印刷碳電極(screen-printed carbon electrode, SPCE)進行修飾，如圖1所示，其兩段線性范圍分別為0.53～5.34 mg/kg和 5.34～45.42 mg/kg，檢測限為21.91 μg/kg。該傳感器催化活性提高，抗干擾能力強、穩定性、重復性良好。

圖1 rGO-蛋氨酸/SPCE電極改性過程示意圖[18]Fig.1 Schematic representation of modification process of rGO-methionine/SPCE[18]

然而，此法用于檢測檸檬黃大多是采用直接催化的形式，容易受到其他偶氮類色素如日落黃、莧菜紅、胭脂紅等的干擾，特異性差，因此通過尋找和合成原料成本低、電催化性能和導電性良好、比表面積大的電極改性材料和有機材料、無機材料及納米材料這3類改性材料進行有機結合，提高電極的選擇性、改善傳感器的電催化活性、增強待測物的響應信號，使傳感器擁有良好的抗干擾能力、重復性以及對檸檬黃分析檢測的高性能，如基于碳量子點和鉑納米粒子裝飾的三維多孔還原氧化石墨烯修飾的絲網印刷碳電極(Pt/CQDs@rGO/SPCE)用于檢測檸檬黃，在存在幾種具有相似結構的干擾劑和偶氮染料染色劑仍具有高選擇性[19]。同時，已有研究表明，離子液體改性的電化學傳感器檢測檸檬黃，其穩定性、溶解性和導電性更好，比表面積大，生物相容性好，靈敏度高且低毒環保。隨著研究的深入，曾經不被科研人員看好的離子液體同樣能夠用于電極修飾，提高電極對檸檬黃的選擇性[20-21]。

2.2 熒光探針法

目前熒光探針法對檸檬黃的檢測多是基于對特異性探針熒光的動態淬滅或靜態淬滅(aggregation-caused quenching, ACQ)機制，從而建立特異性熒光傳感器，熒光淬滅程度與一定范圍內的待測物濃度成線性關系。此法分析速度快、靈敏度高、操作簡便、可供選擇參數多。所使用的探針主要由無機分子、有機分子、納米材料等進行制備，但部分特異性探針的篩選、制備過程較為繁瑣，對反應條件要求苛刻，影響其商品化生產[22]。

劉凌飛等[23]采用酸堿中和自放熱法，以葡萄糖為碳源制備氮磷氯共摻雜碳量子點(N,P,Cl-CDs)，可能是基于靜態淬滅實現對檸檬黃的檢測，其線性范圍為5.34×10-3～8.02 mg/kg。將本法運用于果凍、糖果等實際食品體系中檸檬黃的檢測，加標回收率為97.03%～105.41%，相對標準偏差不超過3.29%。該法靈敏度高、抗干擾性及結果可靠性強。YANG等[24]選用新型熒光探針吖啶黃素，基于靜態淬滅機制實現檸檬黃的快速檢測。如圖2所示，其線性范圍為2.99×10-4～2.67 mg/kg，檢測限為9.08 μg/kg，將本法運用于檢測軟飲料中的檸檬黃，回收率在 96.0%～103.0%，該法響應快、選擇性好、結果可靠。

圖2 吖啶黃素檢測檸檬黃的示意圖[29]Fig.2 Schematic diagram for the detection of tartrazine by acriflavine[29]

WANG等[25]制備了水溶性牛血清白蛋白熒光鎳納米簇(bovine serum albumin nickel nanoclusters,BSA-NiNCs)，并將其作為熒光探針，如圖3所示，并可能基于此探針與檸檬黃分子之間的分子間相互作用和二次內濾效應從而實現對檸檬黃的檢測。結果表明，線性范圍為5.34×10-3～1.87 mg/kg，檢測限為2.14 μg/kg，該法成本較低、靈敏度高、選擇性強、檢測濃度范圍大，檢測結果較為可靠。

圖3 熒光鎳納米團簇的制備過程[25]Fig.3 Preparation process of NiNCs[25]

基于ACQ原理的熒光探針法對被檢樣品要求高、結果容易受到溶劑、緩沖液、溫度、pH等環境因素影響，光穩定性差，斯托克斯位移窄。因此抗干擾性差，易出現假陽性結果。因此在檢測時可以優先選擇抗干擾性強的基于聚集誘導發射(aggregation-induced emission, AIE)的熒光法，此法信噪比更高、光穩定性更好且斯托克斯位移更大，結果更加準確，實現檸檬黃的快速準確檢測[26]。此外，部分有機探針水溶性較差，金屬納米探針在制備過程中無法精確控制其結構和尺寸、生物毒性大、易污染環境、成本相對較高、規模化制備與量產不足使其應用受限[27]。而碳點(carbon dots,CDs)作為一種無機新型熒光納米材料，具有成本低、水溶性好、靈敏度高、生物相容性好、對環境友好等優點而被廣泛應用于制備熒光探針，但其熒光量子產率低，熒光現象不夠明顯，可以通過摻雜不同元素改變內部電子結構，從而改變 CD 的固有屬性，提高熒光量子產率，同時通過采用新的制備工藝提高納米探針結構和尺寸的精度，因此CDs成為一種有效的檸檬黃熒光探針，有望實現基于熒光探針法原理的試劑盒的大規模生產，實現檸檬黃的快速大批量定量檢測[28]。

2.3 表面增強拉曼法

拉曼光譜屬于分子振動光譜，能夠反映分子的特征結構，分子振動較弱，特征峰較不明顯。而表面增強拉曼法(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)主要運用化學機制和電磁機制來增強拉曼光譜特征峰，并依賴由 SERS 活性貴金屬(如金和銀)和過渡金屬納米結構產生的等離子體耦合產生的SERS“熱點”，使得分子振動增強，實現對檸檬黃檢測。近年來SERS技術迅速發展，因其特征峰顯著、靈敏度高、檢測時間短、操作便捷、光譜帶窄、無標記指紋光譜、儀器易于小型化、攜帶方便、成本低等優勢，在食品安全、藥物、生物醫學等領域應用廣泛，并成為檢測檸檬黃高效準確的分析工具之一。

SONG等[29]采用多元醇法合成高度均勻且高質量的銀納米線，并將此銀納米線作為SERS襯底，建立了可實現標準檸檬黃溶液定量分析的偏最小二乘模型，結果表明，檢測范圍為0～10 mg/kg，最低檢測濃度為10 μg/kg，該法靈敏度高，檢測速度快，成本低，模型可預測性能良好。LI等[30]用功能化的抗壞血酸制作抗聚集金納米粒子，并作為SERS增強底物檢測檸檬黃，檢測范圍為5.34～5.34×104ng/kg，檢測限為0.43 ng/kg。該法靈敏高、選擇性好、抗干擾能力強、檢測范圍廣，可實現實時檢測，但成本較高，因此科研人員應繼續深入研究，尋找可供替代具有相同檢測效果和性能的低成本原料。WANG等[31]將層狀金屬-有機框架材料(metal organic framework, MOF)納米陣列與金納米粒子通過電沉積進行結合，制成了能夠用于痕量檢出食品中檸檬黃的多功能MOF芯片(S-MOF@Au)。線性范圍為5.34～5.34×105μg/kg，檢測限為0.53 μg/kg。將該芯片用于檢測橙汁、牛奶、蘋果和魚類4種實際食品體系，加標回收率在96.2%～125.1%，相對標準偏差不超過 9.01%，該芯片電導率大大提高，金納米粒子均一性、穩定性強，且制作簡便、檢測范圍廣、靈敏度高、結果準確可靠、重復性強。圖4和圖5展示了部分用于檢測檸檬黃的SERS底物所用材料以及制備過程。

圖4 檸檬黃傳感器的制備過程[32]Fig.4 Preparation process of tartrazine sensor[32]

圖5 花狀 ZnO@Ag納米結構的合成過程示意圖[33]Fig.5 Schematic representation of the synthesis process for the flower-like ZnO@Ag nanostructures[33]

SERS法克服了拉曼光譜靈敏度低的缺陷，然而，目前SERS底物多使用貴金屬納米材料，如金和銀等。而貴金屬納米材料生物相容性、穩定性和均勻性差，且用于制作底物的方法復雜、耗時長、成本高，該法重復性差，準確度不高。為解決上述問題，將半導體材料用于制備底物，半導體材料能一定程度彌補金屬納米材料作為底物的缺陷，底物均勻性好、物理穩定性高?；驅⑦€原氧化石墨烯納米薄片制成納米流體，納米流體熱導率得到顯著提高，檢測結果更加準確可靠，并且損耗的能源更少[34-35]。此外，除了改變SERS底物材料外，還可以通過改進底物的制備工藝降低基板制作成本，增強基板均一性、穩定性，如在Ar中采取一步飛秒激光直接燒蝕技術制造SERS銀基板，過程操作簡便、無接觸、生產效率高[36]。因此，半導體/貴金屬為基板且基板制作工藝簡單的SERS法有望實現檸檬黃的大批量快速檢測。

2.4 毛細管電泳法

毛細管電泳法通過在毛細管中接入高壓直流電場，在電泳力和電滲力的作用下，樣品中的帶電分子與不帶電分子根據不同的電泳遷移率以及分配系數而被分開，還能通過在毛細管柱末端使用緩沖背景電解質和一些添加物進一步提高分離效果，后在紫外分光光度計或熒光光譜儀檢測分析，從而實現對檸檬黃的定量檢測，可分為膠束電動毛細管電泳法、毛細管區帶電泳法、毛細管等速電泳法等。該法高效便捷、消耗試劑少、經濟環保、選擇性較高、應用范圍廣泛，檢測限低、無需借助昂貴設備、對所有離子化合物都能夠進行檢測，水溶性良好，對于摩爾級別的樣品，能夠在10 min內完成檢測，是一種新型液相微分析檢測方法，對于復雜食品基質中檸檬黃的檢測更加適合。

郭芳芳等[37]采用高效毛細管電泳-紫外檢測法對檸檬黃等5種雪糕中常見色素進行檢測，其線性范圍在10～1 000 mg/kg，檢出限為1.2 mg/kg。將該法用于雪糕的檸檬黃檢測中，平均回收率為93.8%～108.5%，相對標準偏差不超過4.19%。該法操作簡便、檢測速度快、結果準確性高。YI等[38]采用非接觸式電導的毛細管電泳法同時測定包括檸檬黃在內的5種食品著色劑，同時并采用場放大樣品進樣(field-amplified sample injection, FASI)預富集技術，富集因子高而操作簡單。其檢測限在0.035～0.055 mg/kg，將該法用于檢測果脯樣品中的檸檬黃，回收率在94.3%～102%，相對標準偏差<5%。該法檢測成本低、速度快、靈敏度高、重復性好、結果準確可靠。BORDAGARAY等[39]采用微乳液毛細管電泳法測定包括檸檬黃在內的4種食品著色劑，線性范圍為2.29～22.89 mg/kg，檢出限為0.68 mg/kg，定量限為2.26 mg/kg。將此法運用于液體果凍和冰棒等16個食品樣品，回收率為90%～100%。該法靈敏度高、選擇性強、檢測耗時短、分析速度快，形成的膠束提供了更多的離子和疏水相互作用位點，促進帶電和不帶電溶質兩者之間的分離，但用于實際食品體系中結果準確性較低，重現性較差。

然而，毛細管直徑細小、光路短小，即使在離心之后過濾器也容易被粒子堵塞，造成分析物殘留。此外，毛細管進樣量小，導致制備標準溶液相對困難，并且電滲會因樣品組成不同而發生變化，檢測結果對溫度、pH等實驗參數較為敏感，使得此法雖然對檸檬黃具有高選擇性，但檢測結果準確性低，重現性差。針對上述問題，可采用預富集技術增大待測物的濃度，使得該法準確性、靈敏度在一定程度上得到改善。

2.5 免疫學法

免疫學法主要借助酶聯免疫標記技術，通過修飾檸檬黃與酶偶合成抗原，再利用動物免疫實驗獲得特異性抗體，抗原與相應抗體結合后通過同位素標記法等標記技術加以放大和顯示，從而實現對檸檬黃定性或定量檢測。該法操作簡便、易于控制、分析時間短、檢測迅速、特異性強、靈敏度高[40]。

LI等[41]基于活性酯法、混合酸酐法制備半抗原，如圖6所示，并采用超靈敏的間接競爭性酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)測定檸檬黃，線性范圍為0.029～0.440 μg/kg，檢測限為0.014 μg/kg，將該法用于檢測橙汁中的檸檬黃，測定內和測定間的回收率分別為89.33%～109.70%和81.33%～93.43%，變異系數分別為7.54%～12.35%和5.90%～10.48%，該法靈敏度好、選擇性高、抗干擾能力強，結果準確可靠。任立松等[42]通過將檸檬黃分子與卵清蛋白、牛血清白蛋白偶聯制備抗原，并建立間接競爭ELISA檢測方法，結果表明，最低檢出濃度為0.36 μg/kg，檢測限低、檢測速度快，加之成本低，可以應用于大批量樣品中檸檬黃的檢測。LEI等[43]開發了一種競爭性ELISA用以檢測尿液中的檸檬黃，其線性范圍為0.04～1 000 μg/kg，檢測限為0.04 μg/kg。該法操作簡便、靈敏度高、特異性強、選擇性高、抗干擾能力強。

圖6 檸檬黃半抗原、免疫原和包被抗原的合成[41]Fig.6 Synthesis of the tartrazine hapten, immunogen and coating antigen[41]注：KLH-鑰匙孔帽同花色苷；OVA-卵清蛋白；BSA-牛血清白蛋白；Tar-檸檬黃

然而，該法檢測結果與所用抗體的質量有較大關系，對抗體來源和親和力的要求高而產量少，無法滿足大批量檢測的要求。同時，受檢樣品中要是存在細胞因子的可溶性受體，可能會對特異性抗體與細胞因子的結合有一定影響，導致檢測結果準確性降低，同時因檸檬黃與其他人工色素的結構較為相似，抗體對于抗原的識別可能會出現假陽性結果，誤判率較高，抗干擾性較弱。因此，為了提高檢測準確度、靈敏度，關鍵在于特異性抗體的制備，而特異性抗體的產生和敏感性與半抗原分子的結合位置和間隔物的長度密切相關。因此目前多是基于活性酯法、混合酸酐法將檸檬黃分子的某些基團共價連接到卵清蛋白、牛血清白蛋白等載體蛋白制備抗原，再通過注射進入實驗動物如BALB/c 小鼠、新西蘭白兔以產生單克隆抗體，能夠有效避免其他相似色素的干擾，選擇性增強。相對于羅丹明等其他色素而言，檸檬黃的化學修飾比較困難，給相應的半抗原制備帶來挑戰，難以進行大批量制備，市面上銷售的相關產品價格較高。因此，如何優化檸檬黃半抗原的制備過程、提高制備效率將是免疫法在檸檬黃快速檢測上得到推廣、實現大批量檢測的關鍵之處。

2.6 各方法的比較

綜上，快速檢測檸檬黃的方法越來越多且日趨完善，檢出限降低，檢出濃度范圍增大，靈敏度提高，已在食品、藥品等多種實際樣品中廣泛應用。為了更好地比較幾種方法，各項指標匯總如表2所示，電化學法靈敏度高、操作簡便、選擇性高，但易受干擾，結果重現性較差；熒光探針法對檢測范圍較窄、成本較高，無法進行大批量檢測；SERS法檢測成本較高、穩定性差；毛細管電泳法靈敏性不高，同時對各種實驗參數敏感，應用性不高；免疫學法對檢測樣品的要求較高，易出現其他相似色素干擾的情況，結果準確度較低，因此在實際中應用較少。

表2 檸檬黃5種快速檢測方法的比較Table 2 Comparison of five rapid detection methods for tartrazine

3 結論與展望

隨著檢測需求日益增加且對檢測的要求提高，高通量快速篩查將成為未來食品檢測的發展方向。目前檢測檸檬黃的試劑盒種類較少，僅能實現對檸檬黃的定性檢測，嚴重限制了快速檢測法在市場中的應用，價格還有進一步下降的空間。積極尋求成本低廉、性能穩定、重復性好的材料，同時結合化學生物傳感技術以用于試劑盒的研發，無疑是解決上述問題的方案之一。綜上所述，快速檢測檸檬黃的方法具有極高的應用潛力和市場價值，隨著科學研究的不斷推進，新的快速檢測方法有望在食品、藥品等領域投入實際應用。