鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素效價(jià)含量方法學(xué)驗(yàn)證

章瑛,楊毅生，張春華，姚閩

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

大多數(shù)抗生素是微生物的次級代謝產(chǎn)物，同時(shí)抗生素本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，每種抗生素大多是幾種相似組分的混合物，加之抗生素的不穩(wěn)定，產(chǎn)品中混雜著分解產(chǎn)物、異構(gòu)物等。所以給抗生素藥品分析檢定工作帶來很大困難。而微生物檢定法是以抗菌活性為指標(biāo)來衡量抗生素中有效成分的效力的一種方法。

本研究以管碟法建立鹽酸萬古霉素口服液中鹽酸萬古霉素的效價(jià)含量測定方法［1-4］，并按《中國藥典》2020 年版四部通則1200 生物活性測定方法、《抗生素微生物檢定法及其標(biāo)準(zhǔn)操作》及《藥品微生物檢驗(yàn)手冊》對建立的方法予以驗(yàn)證［5-6］。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

ZY-300 Ⅳ抑菌圈測定儀、MS205DU 電子天平、ZY-300G 牛津放量器、PYX-DHS600×600×750 隔水式恒溫培養(yǎng)箱、MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器。

1.2 試藥與菌種

萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130360-201302，含量：每毫克相當(dāng)于1 066 萬古霉素單位）；鹽酸萬古霉素口服液（批號：IP013-2008002、IP013-2009001、IP013-2009002，規(guī)格：50 mg/mL）；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅷ號（北京三藥科技開發(fā)公司，批號：200418；北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號：210220；北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20210811，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號：20201205）；菌種：枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，來源于中國食品藥品檢定研究院。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 菌懸液、緩沖液及雙碟制備

2.1.1 菌懸液制備取枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中（36 ℃培養(yǎng)7 d），用革蘭染色法涂片鏡檢，有芽孢在85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65 ℃加熱30 min，備用。

2.1.2 緩沖液的制備磷酸緩沖液（pH6.0）：取磷酸氫二鉀2 g 與磷酸二氫鉀8 g，加水適量溶解，用水稀釋至1 000 mL，搖勻，在115 ℃滅菌30 min，即得。

2.1.3 雙碟制備取直徑約90 mm，高16～17 mm 的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基（編號：Ⅷ）20 mL，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)面上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至60 ℃，加入試驗(yàn)菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5 mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層，放置水平臺(tái)面上冷卻凝固。在每一雙碟中以等距離均勻放置牛津杯4個(gè)，用陶瓦圓蓋覆蓋，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液的制備精密稱取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品用滅菌水制成每1 mL 含1 000 萬古霉素單位的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成100 U/mL 溶液。再將100 U/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成高低劑量溶液，濃度分別為10 U/mL（S1）、5 U/mL（S2）的溶液。

2.2.2 供試品儲(chǔ)備溶液的制備取一份鹽酸萬古霉素口服溶液樣品（1 瓶鹽酸萬古霉素粉劑+1 瓶稀釋劑），先握住鹽酸萬古霉素粉劑瓶的頸部，在硬表面上拍打底部邊緣以松開粉末，然后從瓶子上取下瓶蓋，輕敲密封墊襯套的頂部，以松開可能黏附在襯套上的所有粉末，再緩慢地剝離內(nèi)襯密封墊，取一瓶稀釋劑，搖動(dòng)幾秒，打開稀釋瓶，將倒入約一半的溶液到鹽酸萬古霉素粉劑瓶中，蓋上蓋子并垂直搖動(dòng)大約45 s，然后將剩余的稀釋劑加入鹽酸萬古霉素粉劑瓶中，蓋上蓋子并搖動(dòng)大約30 s，即得50 mg/mL的溶液。精密量取2 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得1 000 U/mL 的供試品儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成100 U/mL 溶液。再將100 U/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋制成高低劑量溶液，濃度分別為10 U/mL（T1）、5 U/mL（T2）的溶液。

2.3 專屬性

用樣品中的稀釋劑代抗生素進(jìn)行試驗(yàn)，未出現(xiàn)抑菌圈。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸萬古霉素專屬性圖

2.4 線性

用上述100 U/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以5 U/mL 為中心濃度（Co），劑距為1∶0.8，用磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋成濃度為2.00、2.56、3.20、4.00、6.25、7.81、9.76、12.20、15.25 U/mL 的系列溶液，按照抗生素生物檢定法第一法管碟法（一劑量法）進(jìn)行線性測定，每一個(gè)濃度為一組，每組4 個(gè)雙碟，在每一雙碟的加菌培養(yǎng)基上置6 枚牛津杯，間隔的3 枚內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品的某一特定濃度Ck，另3 枚內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度Co。經(jīng)培養(yǎng)16 h 后，使用抑菌圈測定儀測定各個(gè)抑菌圈的直徑。分別求得每組3 個(gè)雙碟中心濃度Co所致的抑菌圈直徑平均值及C1-C9所致抑菌圈直徑的平均值（Ck=1-9）。令fk=-，分別計(jì)算fk值，則8 組雙碟可得出f1-9 的9 個(gè)反應(yīng)參數(shù)。以fk值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，得出回歸直線方程式y(tǒng)=6.614 1x-4.560 1，r=0.999 6，在2.00～15.25 U/mL 的萬古霉素濃度范圍內(nèi)，fk（mm）與濃度對數(shù)lgC 線性關(guān)系良好。

2.5 精密度

取鹽酸萬古霉素口服液（批號：IP013-2009001）樣品測定6 次。標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液高低濃度劑量同“2.2.2 供試品溶液制備”，分別為10 U/mL、5 U/mL。結(jié)果平均含量為標(biāo)示量的104.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.49%。見表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 準(zhǔn)確度（回收率%）

制備9 份1 000 U/mL 的供試品溶液，從標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液和供試品溶液中精密量取4 mL、5 mL、6 mL，分別置100 mL 量瓶中，加磷酸緩沖液（pH6.0）稀釋至刻度，搖勻，即得80 U/mL、100 U/mL、120 U/mL 的溶液各三份。按《中國藥典》2020 年版四部生物檢定法第一法管碟法（二劑量法）測定相應(yīng)的含量。分別測定3 次。結(jié)果回收率均在90.0%～110.0%范圍內(nèi)，平均回收率為99.5%。見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 適用性

因本品種對培養(yǎng)基和緩沖液的pH 值較穩(wěn)定，方法較成熟，故只對不同來源培養(yǎng)基及溶液穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。采用4 個(gè)廠家的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果RSD為0.75%，不同品牌培養(yǎng)基對結(jié)果影響較小。見表3。選一批樣品處理后，冰箱冷藏放置1 d、4 d、14 d，分別測定結(jié)果，偏差為0.72%，溶液穩(wěn)定性良好。見表4。

表3 不同廠家培養(yǎng)基測定結(jié)果

表4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

抗生素微生物檢定法分為稀釋法和濁度法兩種方法。其中，管碟法為國際通用方法，國內(nèi)外藥典均收載了此法。此法是根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系，通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。但由于操作步驟及影響因素較多，需要從每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，才能使結(jié)果準(zhǔn)確可靠［7-11］。在此次試驗(yàn)中總結(jié)了如下影響因素。

3.1 前期因素

（1）試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意防止抗生素及微生物的污染，其由樣品處理的試驗(yàn)間和制備雙碟的半無菌間兩部分組成。半無菌間需用紫外線燈達(dá)到空氣消毒，時(shí)間30 min 以上為宜。（2）雙碟和牛津杯的選擇盡量使用同一生產(chǎn)企業(yè)且同一批次。碟子大小不均，底部不平，會(huì)造成培養(yǎng)基厚薄不一，導(dǎo)致抑菌圈不圓，大小差異大，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。牛津杯內(nèi)徑不一和重量差異大，形成的抑菌圈大小差異較大，在培養(yǎng)基平面上下陷的深度不一致，也可使溶液擴(kuò)散不均勻。雙碟和鋼管使用前應(yīng)先用專用洗液進(jìn)行浸泡以后再用水沖洗，瀝干，置150～160 ℃干熱滅菌2 h 備用。（3）培養(yǎng)箱選擇隔水式恒溫培養(yǎng)箱為宜，隔板上備有帶孔的玻璃板并墊平。最主要使用之前要測定水平度，使雙碟放入培養(yǎng)時(shí)不會(huì)由于平面不平而鋼管里液體流出導(dǎo)致破圈或不成圈現(xiàn)象。（4）抑菌圈測定儀的技術(shù)指標(biāo)應(yīng)符合抑菌圈測量儀檢定規(guī)程的要求，尤其是抑菌圈測定的準(zhǔn)確度及精密度的要求，檢驗(yàn)合格方能確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

3.2 試驗(yàn)過程中的因素

（1）鹽酸萬古霉素具有吸濕性，在稱取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)候容易吸濕，故天平室的濕度要控制好并且稱取時(shí)要快速，否則數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)得出的效價(jià)值有偏差。（2）試驗(yàn)菌的敏感度，特別要防止染菌，制備菌層時(shí)含菌濃度要適宜。在雙碟倒入底層和鋪菌層時(shí)一定要鋪平，尤其是菌層，否則影響培養(yǎng)基的厚度H。H 與管中心到抑菌圈邊緣距離r 相互影響：H 增大，r 縮小；H 減小，r 增大。還有在制備菌層時(shí)，培養(yǎng)基溫度不宜過高或者溫度正常但受熱時(shí)間太長，可能會(huì)使試驗(yàn)菌部分被殺死或全部被殺死，從而使抑菌圈破裂或甚至無圈。故最好培養(yǎng)基加熱融化后，置恒溫水箱內(nèi)一段時(shí)間使培養(yǎng)基均勻降溫平衡后，加入試驗(yàn)菌。本試驗(yàn)使用的實(shí)驗(yàn)菌株為枯草芽孢桿菌，芽孢懸液對溫度抵抗力強(qiáng)，可提高培養(yǎng)基溫度到65 ℃，更利于攤布雙碟，如溫度過低，極易凝固，而導(dǎo)致菌層不平。（3）滴加溶液時(shí)候容易濺出落在瓊脂培養(yǎng)基表面上或者鋼管內(nèi)有氣泡。故滴加溶液時(shí)距離管口不要太高，適當(dāng)調(diào)節(jié)，如有溶液濺出可以預(yù)先備好消毒小濾紙片輕輕吸去，這樣培養(yǎng)后不會(huì)影響破圈。另外還需注意滴加溶液的順序和時(shí)間，溶液的高低濃度按照SH-TH-SL-TL 的順序進(jìn)行滴加，每個(gè)雙碟用時(shí)控制在1 min 內(nèi)，避免抗生素在培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散產(chǎn)生差異，降低碟間和劑間的差異，引起可信限率偏大，誤差增大。（4）雙碟疊放不宜超過3 個(gè)，保證雙碟的溫度一致，使試驗(yàn)菌生產(chǎn)速度一致，避免造成抑菌圈變小或者不圓整，減小試驗(yàn)誤差。

本實(shí)驗(yàn)中可能還有未涉及的因素，但各因素往往不是孤立的而是相互聯(lián)系、相互作用和相互影響的。所以在操作過程中，嚴(yán)格按照操作規(guī)范，謹(jǐn)慎小心操作，減少外界與人為因素引起的誤差，使測定結(jié)果與真實(shí)值更為接近，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素的效價(jià)含量測定用的管碟法（二劑量法），該方法抑菌圈直徑與萬古霉素濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，專屬性、精密度、準(zhǔn)確度和適用性均滿足實(shí)驗(yàn)要求，適合用于鹽酸萬古霉素口服液中萬古霉素的效價(jià)含量測定。