微生物多糖調控克羅恩病腸道炎癥免疫反應的機制研究

劉威，黃文峰，周云，孟凡，何良梅

贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000

克羅恩病是一種炎癥性腸病，尚不清楚該疾病的發病機制，主要是遺傳、免疫、環境與腸道微生物生態等多重因素相互作用的結果［1］。克羅恩病變具有進展性發展或反復急性發作，具有較高的發病率，可發生嚴重的并發癥，并且給家庭和個人帶來嚴重的經濟負擔［2］。近幾年發現機體的免疫系統與腸道菌群有著緊密的聯系，腸道微生物通過新陳代謝調節機體免疫系統，而腸道系統能夠主動調節腸道菌群的多樣性從而來影響機體健康［3］。最新研究發現細菌脂多糖（LPS）和1,3-β-D 葡聚糖可激活腸道免疫細胞產生炎性介質，可能參與克羅恩病的發生過程［4］。本研究通過研究微生物多糖調控克羅恩病腸道炎癥免疫反應的機制，為全面解析克羅恩病的致病機制提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物60 只6-8 周齡健康雄性BABL/c 小鼠，體重18～22 g，購自南昌醫學院實驗動物中心［許可證SCXK（鄂）2019-0001，武漢華聯科生物技術有限公司］，將小鼠在濕度為50%、溫度為24 ℃左右條件下適應性喂養1 周。

1.1.2 主要試劑微生物多糖（北京博奧澤科技有限公司）；2，4，6 三硝基苯磺酸（TNBS）50 g/L 水溶液（合肥吉之暢公司）；無水乙醇（合肥吉之暢公司）；PCR 試劑盒（北京靈寶科技公司）；ELISA試劑盒（北京博奧澤科技有限公司）；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）多克隆抗體（上海金穗生物科技公司）；兔源Toll 樣受體4（TLR4）抗體（廣州創融生物科技公司）；兔源MyD88 抗體（廣州創融生物科技公司）；兔源NF-κBp65 抗體（廣州創融生物科技公司）。

1.1.3 主要儀器PCR 儀（美國ABI 公司）；電泳儀槽（北京六一儀器廠）；全自動數碼凝膠成像分析系統 ［亞速旺（上海）商貿公司］；離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組和建模方法將小鼠隨機分為三組，分別為對照組、模型組、實驗組，每組20 只。實驗前，各組小鼠正常飲食，實驗前適應性喂養1 周。首先構建克羅恩病，實驗組和模型組小鼠參照Kim等［5］的方法建立克羅恩病模型，按TNBS 水溶液：50% 乙醇（1∶1）混合，100 μL 肛門灌注一次，造模前禁食24 h、不禁水。對照組小鼠肛門灌注100 μL 生理鹽水。液體緩慢灌注完畢，拔出導管，保持小鼠倒立姿勢60 s，灌腸后正常飼養。每日觀察并記錄小鼠疾病活動性狀，若連續3 d 小鼠體重持續下降，出現血便則造模成功。造模完成后，實驗組小鼠給予灌胃已制備好的微生物多糖溶液0.25 mL/次，模型組和對照組小鼠灌胃等量的無菌水，2 次/d，連續21 d。21 d 后將小鼠頸椎脫臼法處死，取肛門至回盲腸管。

1.2.2 疾病活動度評分每天記錄每組小鼠的體重、大便性狀及便血情況，計算各組小鼠疾病活動指數（DAI）評分［6］。小鼠皮毛光滑程度、糞便隱血、直腸脫垂、糞便形態及腹瀉的情況都是該指數的組成部分。由體重減失率分數和大便隱血程度分數相加而得，DAI 評分為（體重減輕+大便稠度+大便隱血）/3。分值在0～8，體重減失率（%）=（實驗前體重-造模后體重）/實驗前體重×100%。體重減輕率：正常為0 分，1%～5%為1 分，5%～10%為2 分，11%～15%為3 分，＞15%為4 分；糞便性狀：正常為0 分，介于正常和糊狀便之間為1 分，糊狀便為2 分，介于糊狀便和腹瀉之間為3 分，腹瀉為4 分；隱血情況：正常為0 分，隱血陽性為2 分，肉眼可見出血為4 分。其DAI 評分越高，疾病的癥狀越嚴重。

1.2.3 組織病理學評分PBS 洗滌結腸組織，乙醇脫水，二甲苯清洗，包埋，切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察。參照組織學評分標準［6］，僅為結構改變（0 分）；可見慢性炎癥（1 分）；固有層見中性粒細胞浸潤（2 分）；上皮層見中性粒細胞浸潤（3分）；隱窩結構破壞（4 分）；見糜爛或潰瘍（5 分）。

1.2.4 ELISA 檢測血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達水平 抽取大鼠腹主動脈血，4 ℃ 3 500 r/min 離心5 min，按照ELISA 試劑盒說明，稀釋標準品，繪制標準曲線，檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的含量。

1.2.5 Western blotting 分析將-80 ℃各組大鼠結腸組織勻漿后，提取總蛋白，用3 000 r/min 的離心機離心10 min，取上清液。電泳分離蛋白，轉膜，封閉，TBST 清洗后，加入一抗TLR4、MyD88 和NFκB p65（1∶1 000），孵育，添加二抗（1∶5 000）、孵育2 h，分析條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠DAI 評分、結腸長度、結腸病理學評分比較

與對照組相比，模型組和實驗組小鼠DAI 評分明顯升高；與模型組相比，實驗組小鼠DAI 評分明顯降低（P＜0.05）。與對照組相比，模型組和實驗組小鼠結腸長度明顯縮短，且具有明顯充血腫脹；與模型組相比，實驗組小鼠結腸長度伸長，充血腫脹情況改善（P＜0.05）。與對照組相比，模型組及實驗組小鼠結腸組織病理學評分明顯升高；與模型組相比，實驗組小鼠結腸組織病理學評分明顯降低（P＜0.05）。見表1 及圖1。

表1 各組大鼠DAI評分、結腸長度、結腸病理學評分比較（）

表1 各組大鼠DAI評分、結腸長度、結腸病理學評分比較（）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05。

圖1 結腸組織病理切片（HE染色×200）：A.對照組；B.模型組；C.實驗組

2.2 各組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達水平比較

與對照組相比，模型組和實驗組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平升高，IL-10 表達水平降低；與模型組相比，實驗組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平降低，IL-10 表達水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達水平比較（） pg/mL

表2 血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達水平比較（） pg/mL

2.3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達水平比較

與對照組相比，模型組和實驗組小鼠結腸組織炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白表達水平均明顯升高；與模型組相比，實驗組小鼠結腸炎性因子TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白表達均明顯下降（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較（）

表3 各組小鼠炎性因子TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達水平比較（）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05。

3 討論

克羅恩病是炎癥性腸病的一種，針對該疾病的確切發病機制沒有明確的定論，多數研究認為和遺傳、環境、感染、免疫系統異常及腸道炎癥相關［7］。其中免疫因素是重要的發病因素，主要原因是免疫細胞會調控炎癥反應，免疫因素紊亂，導致發生炎癥反應，進一步發生炎癥性腸病［8］。目前已研究證實，腸道黏膜免疫系統所致的炎癥反應在克羅恩病的發生和發展中有著重要的作用，是導致腸道損傷、功能障礙的重要原因［9］。實驗組小鼠結腸長度長于模型組，表明微生物多糖可以增加克羅恩病小鼠的體重及結腸長度。與模型組相比，實驗組血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平降低，IL-10表達水平升高，提示微生物多糖通過調控炎癥因子的表達改善小鼠的炎癥反應。

TLR 主要作用是識別病原微生物，而TLR4 主要是通過非特異性的方式結合并啟動病原相關分子的信號轉導，釋放腸道的炎癥介質，參與克羅恩病的發病。以往的研究已經發現在正常人的腸道中TLR4 水平降低，但在克羅恩病中有著較高的表達水平，這證明了TLR4 在克羅恩病中的作用［10］。克羅恩病小鼠模型的MyD88 蛋白水平明顯高于對照組。MyD88 含有TLR 結構域的接頭蛋白，與Toll 的結構域相互作用，TLR4 可以激活MyD88 通路，最終激活NF-κB，NF-κB 是激活炎癥反應的關鍵轉錄因子。但微生物多糖調控后，MyD88 的表達降低，所以微生物多糖抑制這一通路。NF-κB廣泛存在于各種組織中，主要作用是調節炎癥，同時也是多種信號轉導途徑的匯聚點，在腫瘤及炎癥反應相關基因的表達中起著至關重要的作用。研究表明NF-κBP65 蛋白在克羅恩病高表達，本研究也發現了在模型組小鼠中NF-κBP65 的蛋白水平明顯高于對照組，證明TLR4/MyD88/NF-κB 在克羅恩病炎癥反應中有著重要的作用。

綜上所述，克羅恩病結腸組織中有著高表達的TLR4、MyD88 和NFκB，并且微生物多糖是通過TLR4/MyD88/NF-κB 通路調控克羅恩病腸道炎癥免疫反應。