基于HPLC 建立建昌幫姜天麻炮制前后主成分含量測定方法

鄧紅，陸美霞，歐陽歆怡，雍蕾，鄧捷，葉喜德

1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elataBL.屬植物的干燥塊莖，有平肝息風、通絡止痛之功，常用治驚痛抽搐、肢體麻木、眩暈等證［1］。主含多糖、酚類、揮發油、苷類等成分，有降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抗頭痛、抗氧化、抗凝血、抗炎等多種藥效作用［2-3］。對天麻炮制方法，歷代文獻多有記載。如《雷公炮炙論》首載“蒺藜子制天麻”法［4］；唐代《銀海精微》載“天麻炒至性存”［5］；《顱囟經》以“酒浸一夜”［6］；《補輯新修本草》有“爆干”制法［7］。宋代文獻常以酒制天麻為主，如《史載之方》《太平惠民和劑局方》《傳信適用方》《扁鵲心書》等［8］。而“姜制法”早在清《幼幼集成》就有記載［9］；直到現代，炮制天麻常以蒸制和切制法為主，對輔料炮制研究較少。

姜制天麻是江西“建昌幫”特色飲片。生姜為辛溫之品，有“嘔家圣藥”之稱［10］，所以“建昌幫”提出天麻經姜制后，可祛除天麻之麻味，以減少嘔吐之副作用［5］，達到炮制減毒增效之目的。但姜制對天麻藥效的影響，主要是通過影響其成分變化而實現。研究表明［11］，采用HPLC 法測定姜制天麻與蒸制、硫黃熏蒸品中天麻素含量時，發現姜天麻中天麻素含量明顯高于其他炮制品。本課題組前期以正交試驗設計法、多指標成分評價，考察了姜天麻炮制工藝［12］；并通過氣相色譜-質譜聯用方法，分析了姜天麻炮制前后揮發成分變化差異，結果發現姜制對天麻中的化學成分含量影響較大［13］。基于此，為深入研究姜制對天麻作用的影響，本實驗以不同產地不同批次天麻為研究對象，以比較天麻姜制前后主要成分變化差異，目的是探討姜制對天麻主要化學成分變化的影響，為深入研究姜制天麻炮制機理提供數據支撐。

1 實驗儀器和材料

1.1 儀器

Agilent1100 高效液相色譜儀，電熱鼓風干燥箱（GZX-9076MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠），超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司），低速離心機（TDL-80-2C，上海安亭儀器廠），十萬分之一電子天平（FA1004N，上海精密科學儀器有限公司），數字恒溫水浴鍋（HH-6，國華電器有限公司）。

1.2 試劑試藥

天麻素（批號150927，純度≥98%）、對羥基苯甲醇（批號150708，純度≥98%）購于四川省維克奇生物有限公司；巴利森苷E（PE，批號CHB180224，純度≥98%），巴利森苷A（PA，批號CHB180232，純度≥98%），巴利森苷B（PB，批號CHB180233，純度≥98%），巴利森苷C（PC，批號CHB180234，純度≥98%）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（色譜純）均購于西隴科學股份有限公司；純凈水購于杭州娃哈哈集團有限公司；天麻藥材來源信息見表1。天麻和生姜經江西中醫藥大學藥學院劉應蛟副教授分別鑒定為蘭科天麻（Gastrodia elataBL.）干燥塊莖、姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc）的新鮮根莖。

表1 10批次天麻藥材來源信息

2 實驗方法與結果

2.1 姜天麻的制備

根據《建昌幫炮制規范》中姜制天麻法取原藥材，加入12%姜汁（1 kg 生姜用1 kg 水），悶潤1～2 d，中間顛簸，撒上適量的明礬粉，攪拌均勻，待生姜、礬汁充分吸收后，撈起曬去表皮的水分，用武火隔水蒸1～2 h；放入硫黃柜用定量的硫黃（100 kg 藥材用0.5 kg 硫黃）熏2～3 h，取出；切斜薄片或長薄片晾曬干，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm,5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%→30%A；20～25 min，30%→95%A；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3 標準品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，加乙腈-水（3∶97）溶液制成1 mL 分別含天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 分別為1.003、0.308、0.508、0.994、0.474、0.444 mg 的混合對照品溶液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取天麻生品和姜制天麻粉末各2 g，精密稱定后加30 mL 70%乙醇，稱定重量后在80 ℃下超聲（400 W，40 kHz）40 min，放冷，用70%乙醇補足重量，濾過，精密吸取續濾液10 mL 于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用乙腈-水（3∶97）復溶后移至10 mL 容量瓶中并定容至刻度，濾過，取適量濾液離心（3 000 r/min）10 min，過0.22 μm 濾膜，得供試品溶液，備用。

2.5 系統專屬性與適應性考察

將混合對照品溶液和供試品溶液各進樣10 μL，按“2.2”項下條件測定，結果天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 保留時間分別為6.492、9.832、14.611、15.632、17.533、11.500 min，各色譜峰分離度良好，見圖1。

圖1 HPLC圖：A.混合對照品；B.生天麻；C.姜天麻

2.6 線性關系考察

將“2.3”項下的對照品溶液分別精密吸取1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶，用乙腈-水（3 ∶97）稀釋至刻度，各精密吸取10 μL，按“2.2”項下色譜條件，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

表2 回歸方差、相關系數、線性范圍檢測結果

2.7 精密度考察

按“2.2”項下色譜條件，將混合對照溶液連續進樣6 針，并計算出天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 6 個成分峰面積的RSD 值分別為0.11%、0.18%、0.43%、0.80%、0.32%、0.70%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性考察

采用“2.4”項下方法，將同一批供試品粉末平行制備6 份樣品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進行檢測，并計算6 個指標成分峰面積RSD 值，結果分別為1.20%、1.50%、1.40%、1.80%、2.00%、1.30%，說明方法重復性良好。

2.9 穩定性考察

按“2.3”項下色譜條件，檢測制備0、2、4、8、12、24 h 后的同一天麻供試品溶液，并計算出6 個指標成分峰面積RSD 分別為1.10%、0.50%、0.30%、1.20%、1.10%、0.90%，說明供試品在24 h 內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

稱量已知含量樣品（S1）適量，分別加入高、中、低三種不同濃度混合標準品溶液（6 種成分高、中、低濃度分別為天麻素：1.003、0.669、0.502 mg/mL；對羥基苯甲醇：0.308、0.205、0.154 mg/mL；PA：0.508、0.339、0.254 mg/mL；PB：0.994、0.663、0.497 mg/mL；PC：0.474、0.316、0.237 mg/mL；PE：0.444、0.296、0.222 mg/mL），按照“2.4”的步驟進行配制，并對6 個指標成分進行了測定，計算出6 個指標成分平均回收率為99.80 %、100.67 %、98.44 %、99.81 %、99.89 %、101.66 %，RDS 分別為2.30 %、2.50 %、3.10 %、2.80 %、2.10 %、2.80 %。

2.11 含量測定

取10 批天麻及10 批姜制品粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進行檢測，記錄色譜圖和峰面積，計算各指標成分含量，結果顯示天麻姜制前后6 個指標成分均有明顯的變化。姜制前后天麻素含量范圍分別為0.15%～0.54%、0.32%～0.72%；對羥基苯甲醇分別為0.01%～0.14 %、0.01%～0.10%；PA 分別為0.20%～1.31%、0.27%～0.95%；PB 分別為0.18%～0.61%、0.23%～0.66%；PC 為0.02%～0.11%、0.06%～0.16%；PE 為0.09%～0.19%、0.12%～0.31%。結果表明天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，對羥基苯甲醇、PA 含量有所下降，見表3、表4。

表3 天麻含量測定結果 %

表4 姜天麻含量測定結果 %

3 討論

天麻素、巴利森苷、對羥基苯甲醇、腺苷等均為天麻主要活性成分［14］。在《中國藥典》（2020 版）中，僅以天麻素和對羥基苯甲醇兩個成分作為天麻質量評價指標［1］。研究表明，天麻多糖具降血脂、鎮痛、提高免疫力、改善記憶、抗焦慮、抗驚厥、抑制心肌細胞凋亡、抑制心臟肥大和纖維化改善代謝等多種作用［15］，說明天麻活性成分可通過多種途徑發揮多靶點藥理作用。為此，本研究為擴大天麻活性成分檢測范圍，以天麻素、對羥基苯甲醇、PA、PB、PC、PE 等6 個成分為研究對象，并作為姜制天麻炮制前后主要差異成分的檢測指標，目的是探討姜制對天麻主要成分變化的影響，為深入研究天麻炮制機理提供數據支撐。

結果表明，天麻經姜制后其主要成分含量均有不同程度的變化，其中天麻素、PB、PC、PE 含量有所升高，對羥基苯甲醇、PA 含量下降。而造成這種成分含量變化的主要原因，可能是由于天麻中的巴利森苷類成分，容易在外力作用下發生結構變化所致，如巴利森苷A 可在自身酶作用下降解為對羥基苯甲醇與巴利森苷B［16］。依照本實驗對羥基苯甲醇含量下降結果，可間接說明該化合物有可能發生結構變化，但這種變化的深層次原因仍需有待深入探究。綜上所述，本實驗建立天麻6 個指標成分的測量方法，可為天麻和姜天麻質量標準研究提供依據，也為深入研究天麻炮制變化機理提供參考。