少數民族藥蔓性千斤拔飲片質量標準研究

佘永紅，楊德泉，丁野

1.湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000；2.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南 長沙 410001

《湖南省中藥飲片炮制規范》（2010 年版）［1］千斤拔來源規定：為豆科植物蔓性千斤拔Flemingia philippinensisMerr.et Rolfe 的干燥根，或大葉千斤拔Flemingia macrophylla(Willd.) Prain 的干燥根和莖。蔓性千斤拔是千斤拔的別名［2］，蔓性千斤拔在許多少數民族地區使用歷史悠久，湖南地區土家族藥名為“巴起撇”，苗藥稱“嘎芮咣”，瑤藥名“吊馬樁”。《嶺南采藥錄》［3］記載千斤拔具有祛風去濕，舒筋活絡的功效。現代研究中郭櫓櫓等［4］采用去勢成年雌鼠建立骨質疏松模型，用含千斤拔的混合粉組配方進行試驗，具有一定的改善骨功能的作用。千斤拔祛風除濕，強筋壯骨的功效在現代臨床中應用廣泛，如含有千斤拔的外用制劑正骨水、腫痛靈酊劑及金花跌打酊等，內服藥活絡止痛丸、抗風濕液及鉆山風糖漿等。千斤拔及其制劑治療婦科病療效確切，如補血調經片中千斤拔與諸藥合奏，有補血理氣，調經的功效。湖南地區的民族醫還用于肚氣虛癥、水腫病、腎虛、子宮下垂、偏癱、老年久咳、奶癰等癥的治療，湖南的土家醫用本品與土黨參、倒水蓮、牛皮消等配伍，共奏健肚補氣之功［5］。

千斤拔飲片已被《湖南省中藥飲片炮制規范》2010 年版收載，但是質量標準的可控性亟待提升，為了使千斤拔飲片質量得到更有效的控制，本標準研究修訂了蔓性千斤拔的性狀、薄層色譜鑒別及浸出物測定，增訂了水分、總灰分的檢查，并對飲片中染料木苷和染料木素含量測定方法進行了研究，提升了千斤拔飲片質量標準的可控性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW220D 電子天平（日本島津公司），最大量程：82/220 g，稱量精度：0.01 mg/0.1 mg；Agilent 1260高效液相色譜儀；檢測器：VWD；色譜柱：安捷倫SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型號：880975-902，Agilent 公司；色譜工作站：Rev.B.04.03［16］；ZOOMWO Water Environmental 超純水機；中文液晶超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；DZTW 電子調溫電熱套；XMTD-4000 電熱恒溫水浴鍋；TDZ5-WS 醫用離心機；202 型電熱恒溫干燥箱；KSW 電爐溫度控制器。

1.2 試藥

染料木苷對照品（批號：111709-201702，含量以99.9%計）；染料木素對照品（批號：111704-201703，含量以99.5%計）；千斤拔對照藥材（批號：121502-201803），以上對照品及對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G 板（德國默克公司）；甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其他試藥均為分析純。

1.3 實驗樣品

15 批蔓性千斤拔飲片由湖南省5 家飲片生產企業提供，產地分別來自湖南、云南、廣西，經湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所楊德泉主任藥師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

通過考察15 批飲片的性狀特征，本品呈類圓形或橢圓形厚片或短段，直徑0.5～1.5 cm。外表面灰棕色或紅棕色，有細縱紋及橫長皮孔樣斑痕；切面纖維性，皮部薄，棕紅色，易與木部分離；木部黃白色或淡紅色，具放射狀紋理。微具豆腥氣，味微甘、澀。見圖1。

圖1 蔓性千斤拔飲片圖

2.2 薄層色譜鑒別

分別取15 批樣品，粉碎，過二號篩，取約2 g，加石油醚（60 ℃～90 ℃）30 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，取濾液，置水浴上蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。同法制成千斤拔對照藥材溶液。使用硅膠G 板，點樣量為5 μL，以環己烷-丙酮（8∶3）為展開劑，10%磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結果15 批供試品薄層色譜所顯示的斑點顏色和位置與對照藥材色譜一致。見圖2。

圖2 蔓性千斤拔飲片TLC色譜圖

2.3 檢查

水分、總灰分照《中國藥典》2020 年版四部測定，結果見表1。

2.4 浸出物

照《中國藥典》2020 年版四部水溶性浸出物測定法，用熱浸法測定，結果見表1。

表1 蔓性千斤拔飲片水分、總灰分、浸出物測定結果

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件安捷倫SB-C18 色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫30 ℃。進行梯度洗脫，洗脫梯度見表2。理論板數按染料木苷峰計算不低于8 000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.5.2 對照品溶液的制備精密稱取染料木苷對照品16.45 mg，加60%乙醇制成染料木苷對照品儲備液（328.671 0 μg/mL）。另精密稱定染料木素對照品14.24 mg，加60%乙醇制成染料木素對照品儲備液（283.376 0 μg/mL）。精密吸取上述對照品儲備液，加60%乙醇制成含染料木苷濃度為16.433 6 μg/mL、染料木素濃度為11.335 0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備取本品樣品粉末（過二號篩）約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定重量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，補足減失的重量，搖勻，取續濾液，即得。

2.5.4 系統實用性試驗進樣量：10 μL，結果表明，分離度大于1.5，理論板數均在70 000 以上，樣品中其他成分對染料木苷、染料木素的測定無干擾。見圖3。

圖3 液相色譜圖：A.染料木苷、染料木素對照品；B.蔓性千斤拔樣品；C.空白溶劑

2.5.5 線性關系考察分別精密吸取濃度為328.671 0 μg/mL 的染料木苷及濃度為283.376 0 μg/mL 的染料木素對照品儲備液，制成分別含染料木苷濃度為1.643 4、3.286 7、8.216 8、16.433 5、32.867 1、65.734 2 μg/mL及分別含染料木素濃度為1.416 9、2.833 8、7.084 4、14.168 8、28.337 6、56.675 2 μg/mL 的混合對照品溶液，精密吸取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，以染料木苷、染料木素濃度為（μg/mL）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標進行線性回歸。染料木苷回歸方程為：y=54.917x-7.038 1，r=0.999 9；染料木素回歸方程為：y=80.979x-3.317 9，r=1.000 0。結果表明：染料木苷和對染料木素對照品線性范圍分別在1.643 4～65.734 2 μg/mL 和1.416 9～56.675 2 μg/mL 之間呈良好的線性關系。

2.5.6 精密度試驗取“2.5.3”項下的供試品溶液（批號201911103），按“2.5.1”項下色譜條件測定染料木苷峰面積RSD 為0.27%（n=6），染料木素峰面積RSD 為1.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩定性試驗取“2.5.3”項下的供試品溶液（批號201911103），分別于配制后的0、4、8、12、16、24 h，進行測定，染料木苷峰面積RSD 為0.57%,染料木素峰面積RSD 為0.52%，表明配制后24 h內供試品溶液穩定性好。

2.5.8 重復性試驗取樣品粉末（批號201911103）6 份，按“2.5.3”項制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定，含染料木苷和染料木素的總量（按干燥品計算）分別為0.079%、0.077%、0.079%、0.077%、0.081%、0.079%，RSD 為2.0%，表明該方法重復性良好。

2.5.9 耐用性試驗采用擬定的方法，選用2 種高效液相色譜儀、2 種檢測器，2 根不同品牌的色譜柱，（1）儀器：Agilent 1260 Infinity，檢測器VWD；色譜柱：SB-C18（250 mm×4.6mm，5 μm），型號：880975-902，Agilent 公司。（2）儀器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ，檢測器DAD；色譜柱：Acclaim? Polar Advantage IIC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型號：JADE-PAK，Thermo 公司。平行測定同一生產企業3 個批號的樣品（201911103、201911104、201911105），結果3 份樣品染料木苷和染料木素的總量分別為（1）0.078 7%、0.080 7%、0.079 2%；（2）0.078 7%、0.080 4%、0.079 0%。（1）與（2）測定的3 份樣品含量結果之間的RSD 分別為0%、0.27%，0.18%。結果表明，本方法耐用性良好。

2.5.10 回收率試驗取已測定含量（含染料木苷0.481 1 mg/g、染料木素0.305 8 mg/g）的同一批蔓性千斤拔（批號201911103）供試品9 份，按干燥品計算（水分7.57%），按80%、100%和120%的水平精密加入濃度為328.671 0 μg/mL 的染料木苷對照品儲備液及濃度為283.376 0 μg/mL 的染料木素對照品儲備液各適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，測定結果見表3、表4。

表3 染料木苷加樣回收率試驗結果表

表4 染料木素加樣回收率試驗結果表

2.5.11 樣品測定取15 批蔓性千斤拔飲片按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，測定結果見表5。

表5 蔓性千斤拔飲片測定結果

3 討論

3.1 薄層色譜對照藥材的選擇

蔓性千斤拔的化學成分主含黃酮類化合物，此外還含有羽扇豆醇，β-谷甾醇等［6-8］。近年來有研究羽扇豆醇能抗肝癌、胃癌、人乳腺癌等逐漸成為一大熱點［9-11］。原標準用羽扇豆醇作為對照品進行薄層色譜鑒別，但羽扇豆醇對照品不易購得，因此改為千斤拔對照藥材按原標準方法進行薄層色譜鑒別，達到鑒別目的。

3.2 浸出物溶劑的選擇

原標準用70%乙醇作溶劑，熱浸法測定醇溶性浸出物，本次研究用水為溶劑，熱浸法測定水溶性浸出物，更能體現蔓性千斤拔飲片在湯劑中的煎出率。

3.3 含量指標成分的選擇

蔓性千斤拔所含的黃酮類化合物染料木素是目前研究較多的一種植物雌激素，可以調節機體骨代謝和脂代謝［12］，抗動脈粥樣硬化［13-14］，而且研究發現具有抗腫瘤的生理活性［15-18］，因染料木苷與染料木素可能通過水解反應或糖苷化反應而相互轉化，故本研究選擇染料木苷和染料木素的總量作為含量指標成分。

3.4 含量測定提取方法的選擇

比較不同提取方式（超聲提取，加熱回流提取）、不同濃度乙醇溶劑（50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇）、不同提取時間（超聲提取30 min、加熱回流提取1.5 min）對含量的影響，最終提取方法選擇60%乙醇超聲提取30 min。

3.5 測定結果分析

根據15 批飲片測定結果分析：水分在6.82%～12.88%之間，平均值為9.03%；總灰分在1.73%～3.84%之間，平均值為2.65%；浸出物在15.09%～31.58%之間，平均值為22.08%；含量測定范圍在0.043 9～0.080 8%之間，平均值為0.064 9%。

4 結語與展望

蔓性千斤拔其根入地深長，難以拔起而得名，湖南地區的民族藥主要以蔓性千斤拔的根入藥，湘西地區的苗醫為了保護蔓性千斤拔的野生資源，則根、莖都可用藥，目前通常留根用莖入藥。為了擴大蔓性千斤拔的藥用部位，建議深入研究蔓性千斤拔莖的入藥效果及相應的質量標準。

目前蔓性千斤拔廣泛應用于祛風去濕，強筋壯骨及婦科炎癥等的治療，隨著生活水平的提高，未來中國老齡化程度的加速，需進一步開發蔓性千斤拔的相關藥品，在防止骨質疏松、保護心腦血管及抗腫瘤等疾病中發揮最大療效。