阿克蘇地區幽門螺桿菌CagA、VacA基因分型與胃潰瘍及胃癌的關系*

郭新文，馬文穎，王 雋，古麗米熱·艾海提，朱國林，陳長凱

新疆維吾爾自治區阿克蘇地區第一人民醫院消化內科，新疆阿克蘇 842008

幽門螺桿菌是胃潰瘍疾病的病原體，可導致胃癌的發展[1]。遺傳多樣性可能在幽門螺桿菌的基因型變異中發揮重要作用，使其毒性更強，致病性多樣[2]。幽門螺桿菌攜帶不同的毒力因子，如脲酶、鞭毛、空泡細胞毒素A(VacA)和細胞毒素相關基因A(CagA)，它們在侵襲、定植和細胞增殖中起重要作用[3]。CagA和VacA基因的高遺傳變異與幽門螺桿菌感染嚴重程度有關[4]。VacA基因編碼的VacA毒素可誘導胞質空泡，增加通透性，從而導致胃上皮細胞損傷[5]。VacA基因在信號(s)和中間(m)區域表現出顯著的等位基因變異。s區由兩種主要亞型(s1和s2)組成，s1區還有另外3種亞型(s1a、s1b和s1c)，而m區有m1和m2亞型。s和m區域影響VacA基因的空泡形成活性。VacA區域的不同基因型組合導致不同的致病性水平，比如s1am1和s1bm1產生大量毒素，被認為與s1m2相比毒性要強，產生中度空泡毒素[6]。而s2m1和s2m2由于不能形成液泡，因此被認為毒性較小。s1am1和s1bm1亞型常見于急性胃炎、消化性潰瘍和胃癌患者中，而s2m1和s2m2亞型見于胃潰瘍患者中[7]。CagA是一種細胞毒素相關蛋白，與胃潰瘍和胃癌有關。根據CagA基因重復區的多態性，幽門螺桿菌可分為西方亞型和東亞亞型。CagA基因區域由57 bp區域(第一重復區域；FR區域)和102 bp區域(Western型第二重復區域；WSR區域)兩種類型的重復區域組成[8]。東亞菌株的FR區與西方菌株有相似的57 bp區，但162 bp的重復區完全不同。東亞類型的CagA(CagA AA)在東亞國家更為普遍，并且與西方亞型(CagA GG)相比毒理更強[9]。VacA是一種與幽門螺桿菌定植和相關疾病發生、發展密切相關的特定毒力因子。目前多個研究表明VacA可誘導胃上皮細胞產生自噬。自噬是真核細胞中高度保守的自我更新過程，其特征是將細胞質物質吞噬到雙膜囊泡(自噬體)中，隨后在溶酶體中降解[10]。通常自噬機制可清除功能異常的蛋白質和細胞器，但過度自噬會導致細胞死亡[11-12]。目前研究表明VacA在誘導細胞自噬的過程中必不可少，但其與胃癌發生、發展的關系以及誘導細胞自噬的具體分子機制并不明確。本研究擬探討阿克蘇地區幽門螺桿菌CagA、VacA基因分型與胃潰瘍及胃癌的關系，為阿克蘇地區胃潰瘍及胃癌的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年6月至2021年8月在本院接受胃鏡檢查的276例患者作為研究對象。在胃腸內窺鏡檢查期間，從上述人群胃竇和胃體部分獲得胃組織。納入研究者中胃潰瘍90例(胃潰瘍組)、胃癌86例(胃癌組)、胃組織正常100例(正常對照組)。胃潰瘍或胃癌患者納入標準：(1)符合胃潰瘍或胃癌的診斷標準；(2)病理診斷確認為胃潰瘍或胃癌；(3)幽門螺桿菌陽性。排除標準：(1)臨床信息不完整；(2)隨訪失敗或死亡原因不明；(3)有其他消化道腫瘤或疾病；(4)孕婦、嚴重心血管病患者。

本研究為了研究幽門螺桿菌的CagA、VacA基因分型與胃潰瘍及胃癌的關系，還采集了所有研究對象的唾液標本。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本的采集及相關資料的收集 所有標本在-20 ℃下處理和冷凍直至測試。所有標本均在內窺鏡下收集。收集納入研究者年齡、性別、既往病史、飲食習慣和生活方式等一般資料。

1.2.2各組胃組織幽門螺桿菌CagA、VacA基因組DNA提取和基因分型測定 外送金域醫學檢驗中心檢測。采用SDS-PK法從收集的胃組織中提取DNA。將胃組織手動壓碎并重新懸浮在20 μL的10%SDS、80 μL蛋白酶K緩沖液(0.5 mol/L EDTA和4 mol/L NaCl，pH 7.5)、40 μL蛋白酶K(10 mg/mL)中并用無菌水增加至380 μL，將混合物在55 ℃下孵育過夜，加入100 μL的6 mol/L NaCl，然后以14 000 r/min離心5 min，將上清液分離到新管中。為了沉淀DNA，加入500 μL無水異丙醇，充分混合并在9 000 r/min下離心5 min。DNA沉淀用70%乙醇洗滌并風干。將顆粒重新懸浮在50 μL的TE緩沖液(10 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中。樣品儲存在-20 ℃直至使用。使用特異性引物進行PCR以檢測幽門螺桿菌。目標引物CagA：正向5′-TCGAGGGCGCGTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGACGT CGTAGCC-3′，反向5′-TGGGTCGAGCTAGCTAGC GATCGTAGCTAGCTAGCTAGTCGCTC-3′；VacA：正向5′-TGGGTCGTAGCTAGCTAGCTAGCTGATCGA TCGATCGTCGTCA-3′，反向5′-TGGGCTGATCGAT CGGCGGCGTAGCTAGCTGATCGATGCTAC-3′。對于PCR擴增，將1～2 μg DNA樣品添加到含有20 pmol正向和反向引物、1.5 mmol/L MgCl2、1.5 U PCR混合物中的Taq聚合酶(日本Takara公司)、2.5 μL PCR緩沖液和200 μmol/L dNTP的反應體系中，總體積為25 μL。在以下條件下進行PCR擴增：95 ℃初始變性3 min，然后95 ℃ 30 s變性30個循環，退火30 s，72 ℃聚合30 s，最后在72 ℃下聚合5 min(Bio Rad Thermocycler)。PCR反應產物在1.5%瓊脂糖凝膠上用2 000 bp DNA梯(日本Takara)進行電泳，條帶通過溴化乙錠染色顯現，然后用Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)分析。使用靶向16S rRNA和ureA基因的特異性引物檢測幽門螺桿菌菌株。CagA和VacA基因分型是通過PCR使用它們各自的引物從幽門螺桿菌陽性樣品中確定。

1.2.3VacA對SIRT1、FOXO1、P62 mRNA的表達的影響 幽門螺桿菌在37 ℃、微需氧環境且含有10%胎牛血清的腦心浸液培養基中160 r/min振蕩培養。用40%飽和硫酸銨從培養上清液中沉淀蛋白，沉淀的蛋白放到透析袋中透析，并采用抗VacA特異性的IgG抗體柱純化。通過在pH 2.0的酸化F-12/ME培養基中于37 ℃孵育30 min來激活VacA。

從胃癌組織提取原代細胞，置于含VacA的RPMI1640培養基中，在37 ℃、5%CO2的條件下培養，培養至第3代，設為VacA組，用未添加VacA培養基培養的胃癌組織原代細胞設為對照組。細胞經過處理后小心移去6孔板中的培養液，每孔加入1 mL的Trizol裂解液，按照總RNA提取試劑盒(DP419，TIANGEN)進行RNA的提取。目標引物SIRT1：正向5′-GACTTCAGGTCAAGGGAT-3′，反向5′-CCC GCAACCTGTTCCAGCGTGTCTA-3′；FOXO1：正向5′-GTCAGGCTGAGGGTTAGT-3′，反向5′-ACTAAAAGGGAGTTGGTGAAAGACA-3′；P62：正向5′-CTGGGCATTGAAGTTGATAT-3′，反向5′-ATT CTGGCATCTGTAGGGACTGGAG-3′。對于PCR擴增，將1～2 μg DNA樣品添加到含有20 pmol正向和反向引物、1.5 mmol/L MgCl2、1.5 UPCR混合物中的Taq聚合酶(日本Takara公司)、2.5 μL PCR緩沖液和200 μmol/L dNTP的反應體系中，總體積為25 μL。在以下條件下進行PCR擴增：95 ℃初始變性3 min，然后95 ℃ 30 s變性30個循環，退火30 s，72 ℃聚合30 s，最后在72 ℃下聚合5 min(Bio Rad Thermocycler)。分析VacA組和對照組胃癌組織原代細胞中SIRT1、FOXO1、P62 mRNA的表達差異。

2 結 果

2.1各組CagA基因型比較 胃癌組CagA AA基因型頻率高于胃潰瘍組、正常對照組，CagA GG基因型頻率低于胃潰瘍組、正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；胃潰瘍組CagA AA基因型頻率高于正常對照組，CagA GG基因型頻率低于正常對照組,其基因型頻率分布比較差異均有統計學意義(P<0.001)。見表1。CagA AA基因型攜帶者胃潰瘍(OR=10.40，95%CI：5.89～14.70，P<0.05)、胃癌(OR=10.60，95%CI：4.69～21.26，P<0.05)的發病風險增加。

表1 各組CagA基因型比較[n(%)]

2.2各組VacA基因型比較 胃癌組VacA s1m1基因型頻率高于胃潰瘍組、正常對照組，VacA s2m2基因型頻率低于胃潰瘍組、正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；胃潰瘍組VacA s1m1基因型頻率高于正常對照組，VacA s2m2基因型頻率低于正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。VacA s1m1基因型攜帶者胃潰瘍(OR=11.27，95%CI：5.25～13.22，P<0.05)、胃癌(OR=9.26，95%CI：4.19～15.66，P<0.05)的發病風險增加。

表2 各組VacA基因型比較[n(%)]

2.3CagA、VacA基因分型與胃癌發生風險的Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示：CagA AA基因型、VacA s1m1基因型是胃癌發生的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 CagA、VacA基因分型與胃癌發生風險的Logistic回歸分析

2.4CagA、VacA基因分型與胃癌臨床病理特征的關系 從表4可見，CagA、VacA基因分型在不同性別、年齡的胃癌患者中差異無統計學意義(P>0.05)，但腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理級別高級別患者的CagA AA基因型、VacA s1m1基因型比例分別高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、病理級別低級別的患者(P<0.05)。

表4 CagA、VacA基因分型與胃癌臨床病理特征的關系[n(%)]

續表4 CagA、VacA基因分型與胃癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5VacA對SIRT1、FOXO1、P62 mRNA的表達的影響 試驗結果顯示，VacA組SIRT1、FOXO1 mRNA的相對表達水平較對照組顯著升高(P<0.05)，但P62 mRNA的相對表達水平較對照組顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 VacA對SIRT1、FOXO1、P62 mRNA表達的影響

3 討 論

幽門螺桿菌感染具有流行病學多樣性，在不同的地理位置表現出不同的流行程度。盡管有關幽門螺桿菌VacA和CagA毒力基因型多態性的研究較多，但是目前關于我國阿克蘇地區幽門螺桿菌VacA和CagA基因型頻率的相關信息很少。在本研究中確定了胃潰瘍和胃癌患者胃組織標本中的CagA、VacA基因分型。

幽門螺桿菌CagA誘導病理改變，與胃炎、胃潰瘍和胃癌的發展密切相關。幽門螺桿菌CagA AA陽性菌株毒性更強，在胃炎和胃癌中引起更高水平的胃黏膜炎癥。在本研究中，胃癌組CagA AA基因型頻率高于胃潰瘍組、正常對照組，CagA GG基因型頻率低于胃潰瘍組、正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；胃潰瘍組CagA AA基因型頻率高于正常對照組，CagA GG基因型頻率低于正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；CagA AA基因型頻率能增加胃潰瘍、胃癌易感性(OR=10.40、10.60)。本研究結果顯示阿克蘇地區患者中CagA GG基因型的患病率較低。幽門螺桿菌CagA AA基因型在上海的流行率高達93.2%[10]。據報道，我國周邊國家的CagA AA基因型胃病患病率也很高，如：印度的CagA AA基因型胃病患病率高達96.2%[11]，日本52%的幽門螺桿菌菌株攜帶CagA AA基因型，胃癌CagA AA基因型陽性率為80%，十二指腸潰瘍CagA AA基因陽性率為63%[12]。本研究同時也發現，CagA AA基因型是胃癌發生的危險因素(P<0.05)。

VacA基因型的遺傳變異與幽門螺桿菌的毒力狀態直接相關[13]。在本研究中，主要發現了VacA基因的s1m1、s1m2、s2m2亞型，而未檢測出VacA基因的s1b和s1c亞型。本研究結果顯示，阿克蘇地區幽門螺桿菌的VacA各基因亞型分布頻率與其他報告數據的頻率相當。流行病研究報道，s1m1、s1m2、s2m2基因型是中國更普遍的VacA基因亞型，而VacA s1a和VacA m1是印度的主要VacA基因亞型[14]。在另一項研究中，在香港VacA陽性的幽門螺桿菌感染患者中未檢測到s1b亞型，而在67%的人群中發現了s1m1亞型[15]。同樣，本研究也觀察到胃癌組VacA s1m1基因型頻率高于胃潰瘍組、正常對照組，VacA s2m2基因型頻率低于胃潰瘍組、正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；胃潰瘍組VacA s1m1基因型頻率高于正常對照組，VacA s2m2基因型頻率低于正常對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。先前的研究報道了巴基斯坦成人消化不良患者中VacA s1m1基因型頻率為59.6%，在印度人群中VacA s1m1基因型也是優勢基因型[16]。VacA s1m1基因型與高毒素活性顯著相關，并與疾病的臨床結果相關[17]。在對CagA、VacA基因型的詳細分析中，本研究發現，腫瘤最大徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理級別高級別患者的CagA AA基因型、VacA s1m1基因型比例分別高于腫瘤最大徑<2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、病理級別低級別的患者(P<0.05)。此外，在我國東北地區VacA s1m1基因型的胃炎患者存在多種流行病學特征，帶有VacA s1m1基因型的幽門螺桿菌株與增加的毒力能力及更高的胃上皮損傷和潰瘍有關[18]。本研究結果顯示，用添加幽門螺桿菌VacA培養基培養的細胞中，SIRT1、FOXO1 mRNA的相對表達水平顯著升高，但P62 mRNA的相對表達水平顯著降低，提示VacA可通過誘導SIRT1/FOXO1信號軸導致胃癌細胞自噬從而抑制了細胞增殖。有研究表明SIRT1可以與FOXO1結合并使其脫乙酰基，導致FOXO1活化和核易位，在特定情況下，增強FOXO1轉錄活性可以促進自噬。FOXO1的脫乙酰化還可以促進FOXO1與自噬相關蛋白7(ATG7)之間的相互作用，同時增強線粒體自噬受體(BNIP3)的表達。

綜上所述，CagA AA基因型頻率、VacA s1m1基因型頻率能增加胃潰瘍、胃癌易感性。CagA AA基因型、VacA s1m1基因型是胃癌發生的危險因素。VacA能增加SIRT1和FOXO1 mRNA的表達但抑制P62 mRNA的表達，提示VacA可能通過SIRT1/FOXO1信號軸誘導胃癌細胞自噬，是幽門螺桿菌在胃上皮細胞內存活的自我保護機制。對自噬的深入研究將為預防胃癌的發生、發展提供新的思路，同時希望在將來可以通過精準地調節自噬來更有效地治療胃癌。