燒傷患者耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的環境追蹤研究

曾 凌，徐 珍，戴小華，劉 洋，朱春梅，劉 蓬

(南昌大學第一附屬醫院 1. 感染控制處； 2. 燒傷醫學科； 3. 檢驗科，江西 南昌 330006)

燒傷患者由于皮膚黏膜屏障受損，更易發生多重耐藥菌感染，引起嚴重膿毒癥、感染性休克，成為主要致死原因之一[1-2]。目前，國內外耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的耐藥形勢嚴峻，感染患者的病死率可高達30%～70%[3]，并有在燒傷病房內流行的趨勢，給臨床用藥和治療帶來巨大困難[4]。燒傷創面感染與環境(內環境和外環境)密切相關[5]，多重耐藥菌的環境同源性分析和細菌定植等研究成為目前醫院感染防控的研究重點和熱點之一。但目前國內相關研究均為回顧性調查，往往是發生感染或感染暴發后再進行調查分析，缺乏基因同源性分析的科學依據[6]。本研究采用前瞻性研究方法，開展燒傷患者CRKP感染環境的追蹤，查找感染患者與環境之間的傳播鏈，明確傳染源及傳播途徑，以期為燒傷患者感染的防控與治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 病例篩選及調查 應用“醫院感染實時監控軟件”對燒傷科重癥監護病房(ICU)患者進行實時監測，確定并選取CRKP感染病例。對納入的CRKP感染病例進行危險因素調查，調查內容包括年齡、性別、燒傷程度、基礎疾病、送檢標本類型、送檢時間、侵入性操作(呼吸機、中心靜脈置管等)、抗菌藥物使用、住院時間及預后等。

1.2 標本采集及方法 臨床采集CRKP感染燒傷患者的消化道、分泌物和血等標本，進行內環境的追蹤。對CRKP感染燒傷患者所處的外環境進行追蹤調查，包括床單元(床單、被套、床墊等)、生活衛生用品、床頭柜表面、醫療儀器設備表面、工作人員手、工作服和病區空氣等。

臨床患者標本采集參照《醫院感染預防與控制操作指南SOP》的操作標準執行；外環境的標本采集參照《醫療機構消毒技術規范》WS/T 367—2012的操作標準執行。采用蘸有無菌生理鹽水的棉拭子對環境物體表面進行采樣。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)對采集菌株進行鑒定和藥敏試驗。藥敏結果判定依據2020年美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標準。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.4 同源性分析 采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel eledtrophoresis, PFGE)和多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)的檢測方法，確定菌株的DNA同源性，明確菌株的分子分型。沙門氏菌H9812用作標記菌株，XbaI酶進行酶切，BioNumerics軟件(version 4.0;AppliedMaths)分析PFGE凝膠圖像條帶，相似度≥80%認為菌株屬于同一基因分型。對7對管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB7進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增、測序，根據序列結果進行比對分型，獲得序列型別(sequence-type,ST)[7]。

1.5 莢膜血清型及毒力基因檢測 采用PCR對CR-hvKP菌株進行莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)檢測以及4個毒力因子基因檢測[包括莢膜(rmpA、rmpA2)和鐵載體(iutA、iroN)]。PCR的擴增引物、體系和擴增條件參照相關文獻[8]進行。

2 結果

2.1 患者臨床基本資料 2020年6—12月共有4例燒傷患者發生CRKP感染，2例患者標本為創面分泌物，2例為血，均無基礎疾病。4例患者均為Ⅲ度以上燒傷，經歷多次清創手術，均采用聯合抗菌藥物治療。患者住院時間為20～47 d，年齡為37～50歲。預后情況：1例血液中分離出CRKP的患者死亡，2例患者好轉，1例患者治愈出院。見表1。

表1 4例CRKP感染燒傷患者臨床基本情況Table 1 Basic clinical information of 4 burn patients with CRKP infection

2.2 菌株檢出情況 共采集臨床患者與環境標本152份。其中臨床標本12份，環境標本140份(床單元40份，醫療器械40份，病區60份)。經細菌鑒定，分離出肺炎克雷伯菌18株，其中環境標本分離13株，臨床標本分離5株。經藥敏試驗，最后共分離出CRKP菌株15株，其中臨床標本4株，分別為1、2號患者血標本，3、4號患者創面分泌物標本；環境標本11株，主要為患者床旁隔離衣、呼吸機和醫護人員手等。見表2。

表2 CRKP感染患者臨床及環境標本菌株檢出情況Table 2 Isolation of bacterial strains from clinical and environmental specimens of patients with CRKP infection

2.3 菌株同源性分析結果 對15株CRKP分離株進行PFGE分型，通過PFGE分析，經聚類分析獲得結果為A～G 7個聚類組，1號患者的血標本、2號患者的血標本及環境標本、3號患者的創面分泌物及環境標本具有同源性，為同一型別A型。將A～G型別的菌株進行MLST分析，結果分別得到A～G型為ST11、ST35、ST1、ST37、ST2929、ST23、ST17。見圖1。

圖1 15株CRKP菌株同源性分析聚類圖Figure 1 Cluster diagram of homology analysis of 15 CRKP strains

2.4 毒力基因及莢膜血清型檢測情況 對15株CRKP菌株進行毒力基因檢測，K1、K2和K5型均未檢出，其中5株K57型，ST型別為ST35、ST37和ST17。而未分型菌株以ST11型為主。見表3。

表3 15株CRKP毒力基因及莢膜血清型檢測情況Table 3 Detection of virulence genes and capsular serotypes of 15 CRKP strains

3 討論

燒傷病房是醫院多重耐藥菌感染監測的重點區域，極易發生細菌定植。燒傷患者因皮膚黏膜屏障受到破壞，影響機體正常的防御機制，并通過受損部位引起感染[9]；此外，吸入性損傷、導管插管操作、住院時間長、機體免疫力下降等原因，也使燒傷患者發生感染的概率大大增加[10]。目前，在抗菌藥物的選擇壓力下，燒傷患者發生CRKP感染的情況日益增多[11]，并呈流行趨勢。

本研究前瞻性監測燒傷病房患者CRKP感染發生情況，以預防和控制CRKP醫院感染暴發。對患者周圍環境進行監測，共分離出11株CRKP菌株。采用PFGE對其進行分子分型，共分為7個克隆組。病例1、2、3的床位分別為11、12、2床，患者1、2號的診療及護理為同一組醫護人員，患者3號為另一組醫護人員。1號患者雖早入院10 d，但與2號患者CRKP菌株檢出時間間隔2 d，1、2號患者的血標本及環境標本、3號患者的創面分泌物及環境標本共7株CRKP菌株高度同源，為同一型別A型，ST序列型別均為11型。可考慮此菌株為不同區域間的水平傳播導致，研究[10-12]證明感染者與其診療環境間存在相互傳播，本研究中患者床旁隔離衣和醫務人員手CRKP檢出率高，患者極大可能通過接觸醫院環境而感染。燒傷患者創面破壞了人體原有的微生態平衡，污染的物體表面清潔消毒不徹底或手衛生未嚴格執行，將會造成細菌定植，成為傳染源[13]。另外，由于機體腸黏膜屏障的應急損傷，腸道內毒素和微生物等有可能成為創面的一個內源性感染來源[14]。創面感染后如未能得到有效控制，繼而導致的敗血癥是創面患者死亡的主要原因之一。

傳統觀點一直認為，細菌耐藥性與毒力呈負相關，然而隨著毒力-耐藥雜合質粒的不斷報道，高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌成為新型超級細菌[15]。我國CRKP中高毒力肺炎克雷伯菌以7.4%～15%的分離率位列世界前列[16]。本研究毒力基因檢測中檢出5株K57型，以ST35型別為主，提示該院燒傷科ICU出現局部CRKP克隆株流行，可能合并高毒高耐藥，下一步應開展更大范圍的監測。臨床在對燒傷患者創面抗感染治療時應給予足夠重視。細菌的耐藥性是臨床抗感染治療的難點之一，與燒傷患者治療過程中長期大量使用抗菌藥物密切相關，應及時根據患者感染的病原菌種類及藥敏結果，合理選擇抗菌藥物[17-18]。

本研究通過對CRKP感染燒傷患者的內、外環境進行前瞻性研究，結果表明燒傷患者CRKP感染與環境之間有傳播鏈。了解燒傷患者感染的危險因素，明確傳染源及傳播途徑，對感染病例進行實時監測并及時追蹤干預，從源頭上阻止醫療機構相關醫院感染暴發的可能。

本研究也存在一定不足之處：CRKP感染患者較少，導致樣本量不夠，因此后期仍需繼續前瞻性監測，加大樣本量；另外，本研究中對外環境中菌株和臨床菌株進行了同源性分析，但同源性分析結果并不能證實外環境中菌株與臨床菌株父子親緣關系，因此不能說明環境中多重耐藥菌是由環境中傳播至患者還是患者傳播至環境中，亦或是兩種模式均有，多重耐藥菌傳播模式關系并不清楚[19]。同時國內外亦無相關研究報道，需要進一步進行研究，也是本課題組的下一步研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。