孕產婦生殖道無乳鏈球菌的血清型分布及耐藥基因分析

劉 潔，彭永正,2

(南方醫科大學珠江醫院 1. 檢驗醫學部； 2. 輸血科，廣東 廣州 510280)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)是孕產婦和新生兒感染的常見病原菌，主要定植在女性下消化道或泌尿生殖道。孕婦妊娠期間身體免疫力降低，母體易感染GBS，引起孕婦流產、早產、胎膜早破、羊膜炎及子宮內膜炎等一系列的妊娠并發癥，并通過母嬰垂直傳播給新生兒，導致新生兒感染，引起新生兒肺炎、血流感染、腦膜炎等嚴重感染性疾病，甚至導致新生兒死亡[1-3]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，GBS對四環素、紅霉素、克林霉素均有不同程度耐藥[4]，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰。本研究分析孕產婦生殖道GBS的血清型、耐藥譜及耐藥基因，為臨床防治GBS感染提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 根據《預防圍產期B族鏈球菌病(中國)專家共識》[5]，選擇2020年1月—2021年6月入住某院妊娠晚期且生殖道分泌物檢出GBS的孕產婦為研究對象(n=62例)，年齡20～38歲，孕周35～37周。排除習慣性流產、有其他明確感染因素、有嚴重妊娠并發癥及內科疾病的孕婦。研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采用一次性無菌陰道拭子，在受檢孕婦陰道下段1/3處旋轉1周，收集陰道黏膜分泌物標本，置于無菌試管送檢。

1.2.2 病原菌的分離培養、鑒定及藥敏檢測 按照第四版《全國臨床檢驗操作規范》相關要求，陰道黏膜分泌物接種于血瓊脂培養基，置于35℃，5% CO2培養箱中，培養24 h后采用VITEK 2 Compact微生物系統進行病原菌鑒定及藥敏試驗，藥敏結果判定參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2021年的藥敏標準[6]。

1.2.3 克林霉素誘導耐藥性試驗(D試驗) 采用K-B紙片瓊脂擴散法(K-B法)檢測GBS大環內酯類的耐藥表型，GBS對紅霉素及克林霉素有4個耐藥表型[7]：若病原菌對克林霉素和紅霉素均表現為耐藥，即為內在型(cMLSB)表型；若病原菌對紅霉素耐藥，且靠近紅霉素紙片一側的克林霉素紙片出現類似字母D的抑菌環，D試驗為陽性，即為誘導型(iMLSB)表型；如果病原菌對紅霉素敏感或中介，而對克林霉素耐藥，即為L型表型；如果病原菌對克林霉素敏感，對紅霉素耐藥，即為M型表型。

1.2.4 GBS血清分型與耐藥基因檢測 使用QIAGEN DNA提取試劑盒提取GBS DNA，根據參考文獻[8-9]，設計GBS血清分型與耐藥基因聚合酶鏈式反應(PCR)引物序列(見表1、2)。參考Poyart等[8]基于GBS的cps基因差異性建立多重PCR方法，對GBS進行快速、準確地血清型分型。本研究的引物均由擎科生物公司合成，采用PCR擴增法檢測GBS血清型與耐藥基因，將PCR擴增產物送至擎科生物公司進行測序，并通過BLAST基因數據庫進行序列比對分析。

表1 GBS的血清型PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences of GBS serotypes

續表1 (Table 1， Continued)

表2 GBS的四環素、紅霉素、克林霉素耐藥基因PCR引物序列

2 結果

2.1 GBS不同血清型分布 62株GBS共檢出5個血清型，GBS血清型分別為Ⅲ型(30株，48.4%)、Ⅰa型(16株，25.8%)、Ⅰb型(8株，12.9%)、Ⅴ型(6株，9.7%)、Ⅵ型(2株，3.2%)。見圖1。

2.2 GBS對常見抗菌藥物的藥敏結果 GBS對四環素、紅霉素、克林霉素有較高的耐藥性，耐藥率分別為77.4%、71.0%、67.7%，對氨芐西林、青霉素、喹奴普丁/達福普汀、利奈唑胺、萬古霉素敏感率為100%，未發現對常見抗菌藥物中介的菌株。見表3。

2.3 GBS耐藥菌株主要耐藥基因檢測結果 耐四環素GBS檢出tetM 36株(75.0%)、tetO 16株(33.3%)、tetL 2株(4.2%)，耐紅霉素GBS檢出ermB 32株(72.7%)、mefA/E 10株(22.7%)、ermA 8株(18.2%)、ermTR 6株(13.6%)，耐克林霉素GBS檢出linB 18株(42.9%)。見圖2。

注：M為DLl 000 Marker，Ⅲ、Ⅰa、Ⅴ、Ⅰb、Ⅵ為對應的血清型基因。圖1 GBS血清分型PCR擴增產物電泳圖Figure 1 Electrophoresis map of PCR amplification products for GBS serotyping

表3 62株GBS對常見抗菌藥物的藥敏結果[株(%)]Table 3 Drug susceptibility test results of 62 GBS strains to commonly used antimicrobial agents (No. of isolates[%])

注：M為DL1 000 Marker，tetM、tetO、tetL、ermA、ermB、mefA/E、ermTR、linB為對應的耐藥基因。圖2 GBS耐藥基因PCR擴增產物電泳圖Figure 2 Electrophoresis map of PCR amplification products for GBS drug resistance genes

2.4 GBS紅霉素和克林霉素耐藥表型 耐藥表型主要以cMLSB表型為主，占75.0%，其次是M表型(占12.5%)、L表型(占8.3%)、iMLSB表型(占4.2%)。其中cMLSB表型主要由ermB(44.4%，16/36)基因、ermB+linB(27.8%，10/36)基因介導。見表4。

表4 GBS紅霉素和克林霉素耐藥表型與基因型的關聯Table 4 Correlation between erythromycin and clindamycin resistance phenotypes and genotypes of GBS

2.5 GBS不同血清分型中不同抗菌藥物耐藥基因情況 Ⅲ型血清型攜帶的耐藥基因主要為ermB(66.7%)、tetM(46.7%)、linB(46.7%)、tetO(40.0%)，Ⅰa血清型攜帶的耐藥基因主要為tetM(75.0%)，Ⅰb血清型攜帶的耐藥基因主要為ermB(75.0%)，Ⅴ血清型攜帶的耐藥基因主要為tetM(100%)，Ⅵ血清型攜帶的耐藥基因主要為tetM(100%)。見表5。

表5 GBS不同血清分型中不同抗菌藥物耐藥基因檢出情況Table 5 Detection results of antimicrobial resistance genes in different GBS serotypes

3 討論

GBS是圍產期感染的常見病原菌，常定植在女性下消化道或泌尿生殖道。GBS可以通過產道擴散感染子宮，引起子宮內膜炎和血流感染，并且具有一定的垂直傳播率，可以引發早產、胎兒窒息和新生兒嚴重的感染性疾病[1-3]。近年來，關于GBS引起新生兒感染的報道屢見不鮮，GBS造成的母嬰感染逐漸受到醫學界關注，成為國內引起孕婦及嬰兒感染的重要病原菌。因此，了解GBS血清型、耐藥譜及耐藥基因，有助于預防和治療母嬰GBS感染。

GBS表面的莢膜多糖是其重要的毒力因子，還可以作為血清學分類的主要依據。因此，了解GBS血清型對確定其致病性非常重要[10]。按GBS上莢膜多糖類型可分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ等10種血清型，其中5種(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)是GBS的主要類型[11]。本研究根據分子血清分型檢出5種血清型(Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ)，主要為Ⅲ、Ⅰb、Ⅰa(87.1%)血清型，與國內報道[12]的血清型分布和占比(93.0%)基本一致。其他研究[13-14]中不同地區的主要血清型，如巴西Ⅰa、Ⅱ、Ⅰb血清型(65.4%)與加拿大Ⅲ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ、Ⅳ血清型(92.9%)，與本研究血清型分布不同。因此，由于不同國家的地域性差異、研究對象的個體特征不同，GBS的血清型分布也存在著空間以及人群差異。報告[15]顯示，Ⅲ型血清型在新生兒感染病例中檢出更多，其致病性也較其他血清型強。本研究Ⅲ型血清型高達48.4%，應予以重視。GBS的莢膜多糖(CPS)不僅是血清分型的基礎，也是疫苗研究的重要靶點。疫苗是預防GBS感染最有效的方式，了解GBS血清型分布對開發基于CPS的多價疫苗至關重要。

根據美國GBS醫療指導方針，GBS對大多數β-內酰胺類抗生素敏感，青霉素是治療GBS感染的首選藥物[5]。本研究顯示，GBS對氨芐西林、青霉素的敏感率為100%，故二者可以作為治療GBS感染的一線用藥，但需注意過敏反應。克林霉素與紅霉素曾被廣泛作為治療GBS感染的二線用藥，然而GBS對克林霉素與紅霉素的耐藥率逐漸上升，已引起世界范圍內的關注，且我國報道的耐藥率高于國外相關報道[4,16]。本研究中GBS對克林霉素和紅霉素具有高度耐藥性，耐藥率分別為67.7%、71.0%，建議臨床對兩者的用藥予以重新評價；對四環素的耐藥率最高，為77.4%，臨床應予以重視。雖然未檢測到奎奴普丁/達福普汀、利奈唑胺、萬古霉素的耐藥菌株，但萬古霉素具肝腎毒性，在孕產婦中的使用受到限制，而奎奴普丁/達福普汀及利奈唑胺也不適用于孕產婦的抗感染治療。因此，針對GBS感染，青霉素可作為一線用藥，對青霉素過敏者要做藥敏試驗，并根據試驗結果選擇適當抗菌藥物，以達到及時、有效的臨床療效。

本研究GBS耐藥譜表明，GBS對紅霉素、克林霉素、四環素具有不同程度的耐藥性。ermA、ermB、ermTR和mefA/E是紅霉素耐藥基因。erm基因編碼的甲基化酶引起核糖體構型改變，使作用于抗菌藥物的結合靶位點發生改變，阻礙GBS與紅霉素的結合。mef基因編碼外排蛋白使病原菌主動將紅霉素泵出菌體外，從而產生耐藥[17]。本研究顯示，對紅霉素耐藥的GBS菌株主要耐藥基因為ermB(72.7%)，提示ermB基因介導的耐藥機制可能在GBS耐藥中起主導作用。GBS主要耐藥表型為cMLSB(75.0%)，與國內外近年來的研究數據基本一致[17-18]。分析cMLSB表型的耐藥基因，發現以ermB基因為主。tetM、tetO、tetL和tetK為四環素耐藥基因，tetM和tetO編碼核糖體保護蛋白，使四環素無法與細菌核糖體結合；tetK和tetL編碼外排蛋白，從而產生四環素耐藥[19]。本研究中四環素耐藥主要由tetM、tetO介導，攜帶率分別為75.0%、33.3%。克林霉素耐藥由編碼林可酰胺核苷酸轉移酶的linB基因介導，本研究中linB攜帶率為42.9%。此外，64.5%的GBS同時攜帶紅霉素和四環素耐藥基因，主要為ermB和tetM，多種耐藥基因的出現可能與耐藥基因的水平轉移有關。本研究還發現，GBS菌株中存在特定的血清型-耐藥基因組合，其中Ⅲ型血清型與ermB基因有關，Ⅰa血清型與tetM基因有關。Ⅲ型血清型與新生兒重癥感染密切相關，因此研究血清Ⅲ型GBS的耐藥機制更有臨床意義。

綜上所述，GBS血清型主要以Ⅲ型為主，GBS對四環素、紅霉素、克林霉素有著較高的耐藥性，四環素耐藥以tetM、tetO基因介導為主，紅霉素耐藥以ermB基因介導的cMLSB型為主，克林霉素耐藥以linB基因介導為主。因此，加強對GBS流行病學的監測，有助于更好地了解GBS耐藥流行株的發生及傳播規律，有助于臨床制訂防治方案，對預防和控制耐藥株的產生極為重要。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。