基于腸干細胞治療膿毒癥腸屏障功能障礙的研究進展

梁 群 賈 璇 潘 郭海容 田 圓 王瀚黎

膿毒癥是由于感染引起宿主免疫失調反應而導致臟器功能衰竭的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),亦是引發多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS) 的主要原因。 每年罹患膿毒癥的患者為(1900 ～4890)萬,發生率和病死率持續上漲,約占全球死亡人數的20%,是全球性的健康危機[1]。 長期以來,腸道一直被認為是膿毒癥MODS 的發動機,腸道受損后,內毒素從腸內轉移到循環中,加重膿毒癥[2,3]。 因此,探究膿毒癥相關腸功能損傷機制及基于腸干細胞(intestinal stem cell,ISCs)治療膿毒癥腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的方法,對提高膿毒癥患者治愈率及改善預后生存質量具有現實意義。

正常腸黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、免疫屏障、生物屏障構成,對維持機體正常運轉起重要作用。膿毒癥導致腸黏膜屏障結構發生一系列病理生理變化：腸內穩態破壞,分泌產生腸道蛋白水解酶,腸微生物群組成改變,上皮通透性增加,黏膜機械、化學屏障功能受損,腸內毒素穿過腸屏障到達其他無菌器官定植、過度生長,生物屏障結構改變,引發感染,破壞免疫屏障,出現SIRS、MODS,危及患者生命。

一、腸干細胞概述

腸干細胞(intestinal stem cell,ISCs)是一種未分化且具有高核質比的隱窩底部柱狀細胞(crypt base columnar cells,CBC),因其具有增殖、再生、轉化為分化細胞和產生組織的能力一直備受關注。 干細胞區域的組成包括：位于隱窩底部+1 ～+3 位置、 +4 位置的CBC 以及潘氏(Paneth)細胞[4]。 +4 位置的細胞長時間呈現類靜止狀態,作為功能性干細胞貯備庫,在組織損傷或CBC 缺失情況下激活其“干性”,再次進入分裂狀態;Paneth 細胞通過維持ISCs 生態位影響其增殖、分化[5]。 Paneth 細胞和+4 位置CBC 共同維持ISCs 動態平衡。

根據特性可將ISCs 分為兩大群體：活躍增殖的aISC(actively proliferating intestinal stem cell)和緩慢增殖的儲備rISC(reserve or more quiescent intestinal stem cell)[6]。 有實驗表明,腸道周轉率很大程度上取決于ISCs 的自我更新,即細胞在活躍循環和靜止表型之間的轉換,aISC 介導正常情況下的腸上皮更新,rISC 在組織損傷時完成特定再生任務[7]。

ISCs 具有兩個顯著特點,一是產生多譜系分化的子代細胞,二是長期保持自我更新。 ISCs 產生一個高度增殖的轉擴細胞池,細胞向上遷移到絨毛,并分化為兩個主要的細胞譜系,用于吸收食物的吸收系細胞和用于分泌激素的分泌系細胞[8]。 正常情況下,腸上皮細胞通過ISCs 分化的子代細胞,每3 ～5天更新一次;當腸道受損時,即使ISCs 數量減少,若Paneth 細胞和+4 位置CBC 受損相對較輕,依然能夠恢復腸道功能,維持腸道內穩態。 在修復腸上皮的過程中,Paneth 細胞通過Wnt 配體與Frizzled 受體及其共受體復合物低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 結合,與T 淋巴細胞因子相互作用,識別下游的靶基因,激活rISC,使其“休眠”狀態轉為活躍狀態,加速修復腸上皮黏膜,通過恢復上皮細胞更新,完成ISCs 生態位重建[9]。 與此同時,Notch 信號對腸道祖細胞的增殖和分化有調節功能,通過作用于olfactomedin4 基因,抑制轉錄因子Atoh1 表達,引導祖細胞分化,增加其數量,達到滿足ISCs 增殖的目的[10]。

在ISCs 增殖、分化和凋亡的過程中,受到腸道多重信號的影響,依賴于不同信號途徑的相互作用,以維持ISCs 的穩態,各通路交織成為信號通路網,調控ISCs 的增殖和分化,使腸道內各細胞群處于穩定狀態。

二、膿毒癥相關腸屏障功能障礙

膿毒癥對相關腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance,IBFD)的影響主要包括兩個方面,其一是膿毒癥引起細胞凋亡、壞死,最終導致腸缺血,誘發壞死性IBDF;其二是感染造成的炎性反應損傷黏膜上皮,增加腸黏膜通透性,造成持續進行性IBDF。

1.壞死性IBDF：膿毒癥對腸屏障功能損傷分3個階段推進。 第1 階段損傷是內臟灌注不足或缺血;第2 階段損傷是復蘇期間腸血流的恢復,導致缺血-再灌注損傷;第3 階段損傷是腸屏障功能的喪失,出現腸系膜微循環障礙,造成壞死性損傷。 膿毒癥主要病理機制是“招募”炎性細胞,產生過度促炎反應[11]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖以及損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),包括線粒體DNA、高流動性組蛋白B1 和血清淀粉樣蛋白A 等,導致腸內皮黏附因子水平隨中性粒細胞和巨噬細胞增加而上調,這些一線防御細胞在腸道中產生大量促炎性細胞因子,引發炎性反應,引起細胞大量凋亡和壞死,導致腸道血液灌注不足及回流障礙,引起腸缺血性損傷[12]。 腸道局部缺血早期始于表層,后向腸壁深部發展,腸系膜血流量突然減少或中斷,破壞腸內動態平衡,近端循環中內臟血流量的減少導致深度缺血,甚至誘發腸局部壞死,形成不可逆的缺血性IBDF。

2.進行性IBDF：病原相關分子入血后,啟動病原相關分子模式,脂多糖結合蛋白識別LPS,并與Toll樣受體4(TLR4)結合,活化NF-κB、MAPK 信號通路,引起級聯反應,釋放大量的炎性介質,發生炎性反應[13]。 重癥患者機體防御系統本就脆弱,在這種情況下,機體防御系統“重新編程”,既無法消除原發感染,也無法防止繼發感染[14]。 凋亡和壞死機制損害黏膜上皮,導致DAMPs 進一步釋放,這種惡性循環延續到后續的炎性反應中,導致潰瘍和出血增加,使黏膜穩態失衡加劇[15]。 黏膜穩態失衡,異常激活腸道免疫細胞,改變控制細胞間緊密連接的調節因子[16]。膿毒癥大鼠模型中,可以觀察到緊密連接蛋白和封閉蛋白claudin-1、3、4、5 和8 重新排布,腸上皮內緊密連接蛋白和內皮屏障功能調節因子zonulin-1 超微結構中斷,腸道通透性增加,腸內相關致病因子大量易位,由此產生促炎性細胞因子,發生局部腸道炎性反應[17]。 微循環再灌注恢復后,腸道內DAMPs 首先被吸收到腸系膜淋巴系統,經由腸系膜淋巴管排入乳糜池,在左鎖骨下靜脈進入體循環[18]。 肺動脈是DAMPs 經由腸系膜淋巴管到達的第一個血管,因此,肺也是膿毒癥患者最常見的受累器官;DAMPs 進入體循環后,全身細胞-趨化因子反應的過度釋放,造成急性腎損傷;線粒體功能障礙及內質網應激導致肝衰竭[19]。 由此,膿毒癥造成持續進行性IBDF 的同時,也伴隨各器官的急性損傷,造成MODS 甚至多器官功能衰竭,反向加速膿毒癥進展[20,21]。

三、膿毒癥對ISCs、IBFD 影響及相關治療

膿毒癥對ISCs 及IBFD 影響主要涵蓋兩個基礎點：炎性細胞因子通過信號通路影響ISCs 活性,降低其修復黏膜損傷速度;灌注不足造成腸缺血性損傷影響ISCs 數量,加重黏膜損傷程度。 因此,可以基于以上兩點探究膿毒癥相關IBFD 的ISCs 靶向治療模式。

1.炎性細胞因子影響ISCs 活性：炎性細胞因子通過信號通路影響ISCs 活性。 PI3K/Akt 通路是一個信號轉導酶家族,可調節細胞增殖和存活率,在炎性反應中發揮著負性調節作用;Hippo 通路對于調控組織器官的大小和生長至關重要,YAP 蛋白作為Hippo通路中的核心因子,控制生物器官發育和調控細胞生長[22,23]。

膿毒癥期間,腸道中內毒素刺激PI3K/Akt 通路,誘導產生三磷酸磷脂酰肌醇,Hippo/YAP 信號通路活性被其抑制,當Hippo 信號失活時,LATS1/2 激酶失活,YAP 蛋白不能被磷酸化,YAP 蛋白轉移進入細胞核,結合調控轉錄靶基因的表達,降低ISCs 增殖分化速度,導致黏膜修復速度減緩,加重腸道受損程度、加劇膿毒癥病情發展[24]。

同時,炎性細胞因子通過改變ISCs 對稱分裂模式影響其活性[25]。 ISCs 在爭奪生態位空間、加速增殖分化時主要發生對稱分裂,膿毒癥期間,腸黏膜上皮細胞被破壞,大量炎性細胞因子誘導ISCs 發生不對稱分裂,導致分裂模式紊亂,生成分化潛能低、甚至無分化能力的無效子細胞,具有“干性”的ISCs 數量減少,延緩上皮黏膜修復速度,加速病情惡化。

2.灌注不足造成腸缺血性損傷影響ISCs 數量：隨著缺血時間延長,進行性上皮損傷逐漸向隱窩延伸。 短暫缺血1 ～2h 后,再灌注加劇上皮損傷;缺血3h 后,隱窩組織學損傷逐漸明顯,ISCs 數量有所減少,絨毛上皮完全喪失;缺血持續4h 后,隱窩上皮近乎完全丟失,隱窩上皮細胞的數量明顯減少[26,27]。膿毒癥造成腸缺血性損傷通常大于4h,對隱窩的嚴重損傷已經形成,ISCs 數量銳減,無法進行有效的增殖分化。 膿毒癥期間,腸道組織嚴重缺氧,上皮細胞中的細胞外泌體微RNA-34a 增加,加速ISCs 不對稱分裂,使具有“干性”的ISCs 數量快速減少,ISCs 自我更新和分化能力減弱,無法及時替代凋亡的腸黏膜上皮細胞,屏障功能得不到修復,相關IBFD 加劇。

3.基于ISCs 的治療：ISCs 移植是重建IBFD 患者上皮屏障的一種新型治療方法。 有實驗表明,ISCs可以進行體外類器官培養,與活體中的腸上皮相似,類器官同樣擁有隱窩、絨毛區及由ISCs 增殖分化的各類上皮細胞[28,29]。 為降低組織排斥風險,可以通過內鏡活檢從IBFD 患者的健康腸組織中收集ISCs,同時篩查與膿毒癥相關的突變基因,降低移植后腸道惡化風險,用建立的類器官培養法進行體外擴增,培養到所需數量的細胞后,通過內鏡移植到目標部位。 后期通過評估證實,與患者器官樣培養基比較,類器官簇狀、杯狀細胞表達率更高,最新的臨床評估認為,這種治療方法值得深入研究并大規模推廣[30]。

四、展 望

腸道被認為是系統性炎性反應的來源和MODS的“引擎”,對腸屏障功能的病理生理學解釋還在隨著時間而不斷更迭。 腸道作為膿毒癥患者最先出現相應臨床癥狀的器官,腸黏膜上皮損傷導致IBDF,從局部微循環障礙發展為全身炎性反應、免疫抑制,最終導致機體出現MODS。 近年來,隨著對膿毒癥IBDF 的深入理解,治療重點已從單純的抗炎抗感染轉至修復腸黏膜細胞、糾正黏膜功能障礙的多靶點治療,人們越來越需要找到安全、可行的方式,以恢復或預防膿毒癥患者出現IBFD。

綜上所述,ISCs 是參與IBFD 應答的主要靶細胞之一,不僅是腸道炎性反應中被動的靶細胞,也是一種效應細胞;不單具有修復受損腸黏膜、改善腸道缺血、保護腸組織的作用,在嚴重感染反應造成的IBDF中,還能起到調節內皮細胞功能等保護機制。 故而,靶向ISCs 治療將從根本上調整膿毒癥患者相關IBFD 的治療策略,大幅度提高膿毒癥患者復蘇成功率,最終降低膿毒癥、膿毒性休克及MODS 的病死率,改善預后生存質量。 因此,基于ISCs 療法的研究有望成為醫學、藥學和生命科學等的前沿領域。