初級纖毛相關信號通路在小鼠腭發育中的機制研究進展

廉舒博陳玨蓉何 葦

(遵義醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科,貴州 遵義 563000)

初級纖毛是以微管為基礎的天線狀結構細胞器,在進化上十分保守,是細胞外信號(如生長因子、激素、光、機械刺激、氣味和發育形態等)的傳感器[1]。 有研究報道Hedgehog(Hh)、Wnt、PDGFα 和Ca2+通道等信號受體定位于纖毛膜上[2-4],并對機械應力等多種刺激以及來自細胞外環境的各種信號分子作出反應[5-6]。 初級纖毛的功能或結構缺陷可導致相關信號通路發揮異常,而引起一系列的疾病,稱為纖毛相關疾病[7]。 有研究表明腭的生長發育和融合受Sonic Hedgehog(Shh)、Wnt、FGF 及TGF等多種信號通路調節[8-11],其信號傳導異?？蓪е屡咛ザ喾N器官發育障礙,其中包括腭的發育。 本文對腭發育機制中相關的初級纖毛及相關信號通路作一綜述,以期為先天性腭裂發生的防治提供一定的研究基礎。

1 初級纖毛的結構與功能

初級纖毛(primary cilia,PC)是根據細胞周期和發育規律進行組裝和拆卸的動態細胞器,與細胞的分化狀態和微環境密切相關。 PC 由9 對微管組成的中央軸突組成,由基底體成核,并被富含特定信號受體的雙層脂膜和離子通道所包圍,基底體結構來源于細胞分裂后的中心粒[12]。 在基底和纖毛之間有一個被稱為纖毛過渡區(transiton zone, TZ)的區域,它包含特殊的門控結構,如Y-連接,它與基底體過渡纖維一起,控制纖毛蛋白的進出,從而有助于細胞器的區域化[13]。 除了TZ 和基底體過渡纖維的門控外,纖毛的組成和功能也受到主動轉運機制的調節,包括針對特定受體或信號分子的囊泡運輸途徑[14], 以及纖毛內運輸系統( intraflagellar transport, IFT),它上下拉動軸絲微管,介導特定的纖毛蛋白進入或離開細胞器[15]。

由于初級纖毛缺乏合成其組裝、維持及轉運所需的蛋白質的能力,所以需要依賴于IFT[16]。 IFT是由多蛋白復合體(稱為IFT 蛋白)沿軸絲介導的雙向轉運系統。 IFT 蛋白根據生化特性及運輸方向不同分為IFT-A 復合體IFT-B 復合體。 IFT-B 復合體介導的纖毛蛋白從纖毛基底部運輸到纖毛頂部的運輸稱為順向轉運[17]。 IFT-B 復合體包含了16種 蛋 白 質(IFT20、 IFT22、 IFT25、 IFT27、 IFT38、IFT46、IFT52、IFT54、IFT56、 IFT57、 IFT70、 IFT74、IFT80、IFT81、IFT88 和IFT172),其中,IFT88 是IFTB 復合物的核心組件[18]。 順向轉運還依賴于異源三聚體驅動蛋白-2 蛋白(heterotrimeric kinesin-2 protein, kinesin-2),該蛋白由驅動蛋白-3A(kinesin like protein 3A,KIF3A)和驅動蛋白-3B(kinesin like protein 3B,KIF3B)以及一個附屬亞基運動相關蛋白(kinesin-associated protein,KAP)組成。 從纖毛頂端到基底部的運輸稱為逆向轉運,是由Dynein-2 和IFT 復合體A 介導的[16-17]。 IFT-A 復合體由6 種蛋白組成,包括IFT43、IFT121、IFT122、IFT139、IFT140和IFT144,其中,IFT122 是IFT-A 復合體的中心樞紐[19-20]。 由于PC 自身需依靠IFT 蛋白介導相關信號分子蛋白的轉運,IFT 系統的任何蛋白成分的缺失都會導致初級纖毛結構、功能及相關信號通路的異常,從而引起纖毛相關疾病[7,21]。

2 腭的發育過程

腭的發育過程是顱面部形態發生的重要事件。從宏觀角度來看,腭由原發腭和繼發腭融合而成,原發腭來自中鼻突,并最終形成前牙區的硬腭。 繼發腭來自左右兩個上頜突,并向中線方向生長,但由于舌發育較快,且幾乎充滿了原始口腔,因此繼發腭在舌兩側垂直向下生長;由于下頜骨的長度和寬度的增加以及頭顱因發育而向上抬高等因素,舌的形態變得扁平且位置逐漸下降,繼發腭向水平方向轉動并向中線生長;繼發腭已經達到舌面上方的水平位置,繼發腭繼續向兩個腭突交匯的中線方向快速生長,在兩者中線處接觸,最終發生融合。 在腭發育的過程中,即腭突的生長、上抬、附著、融合中的任何一個過程發生異常,都會引起腭裂發生[22-23]。

3 相關信號通路

3.1 Hedgehog 信號通路

Hedgehog 家族分泌的信號分子對于許多生物體的正常胚胎發育至關重要。 在哺乳動物中,Shh在胚胎內許多區域的發育過程中起著關鍵作用,包括腭部發育。 哺乳動物有3 種Hh 同源蛋白,分別為Sonic Hedgehog (Shh)、Desert Hedgehog(Dhh)以及Indian Hedgehog(Ihh)[2,24]。 Shh 和Ihh 在許多組織中都具有重要功能,有時是重疊的功能,其中Shh信號通路與腭發育的關系最為密切。 Shh 信號通路可通過調節腭胚突上皮-間充質之間的交互作用,從而對雙側腭突的發育產生重要影響[25]。

免疫定位實驗表明,Shh 信號轉導的許多核心成分大多定位在初級纖毛上,并隨著配體的不同作用而改變其分布[24]。 Shh 信號通路涉及與跨膜受體(patched 1,Ptch1)的結合,在沒有Shh 信號的情況下,Ptch1 抑制跨膜平滑蛋白(smoothened protein,Smo)進入PC, Smo 是一種7 次跨膜蛋白,其結構類似于G 蛋白偶聯受體;當Shh 配體存在并與Ptch1結合時, 可將Ptch1 移出PC 并解除對Smo 的抑制,激活的Smo 進入初級纖毛并通過抑制融合抑制因子(suppressor of fused,Sufu)激活Gli 家族轉錄因子(包括Gli1、Gli2、Gli3)以調控Hedgehog 下游靶基因的表達[26-27]。 驅動蛋白家族成員KIF7 是纖毛中Gli 蛋白運輸的最佳候選物,是Shh 信號通路的核心成分。 在沒有Shh 配體的情況下,KIF7 定位于初級纖毛的基部,并與Gli2 和Gli3 相互作用,是Gli3 在Hedgehog 反應中定位于纖毛所必需的。

IFT 蛋白對于物質轉運進出初級纖毛是必不可少的,這些組分的突變可導致纖毛缺陷和人類疾病[7]。 KIF3A 是IFT 系統的重要組成部分,Yuan等[28]采用組織學方法研究KIF3A 缺失對腭部的影響,并用不同的轉基因報告菌株研究KIF3A 基因缺失對Hedgehog 和Wnt 信號的影響。 結果發現KIF3A 缺失導致了神經嵴細胞(neural crest cells, NCCs)對Hedgehog 信號無反應,對Wnt 信號高反應。 這種異常的分子信號導致了細胞增殖異常,并出現繼發性腭裂。 在缺乏KIF7 的胚胎中,Shh 信號通路異常,且Gli2 和Gli3 在纖毛中幾乎檢測不到[29-30]。 由于正常的Shh 功能需要初級纖毛和發生在該細胞器內的Gli 蛋白轉錄活性的精細調控,而這一過程依賴于正常的IFT。 因此,IFT 中任何蛋白的缺失均可影響初級纖毛結構或功能,導致Shh信號傳導失敗,從而影響胚胎內正常組織器官的發育[7]。

IFT88 是初級纖毛的組裝和功能所必需的核心蛋白,介導關鍵發育信號通路的活性。 Tian 等[31]發現在IFT88fl/fl小鼠NCCs 中特異性去除IFT88,可導致腭發育早期神經嵴細胞增殖減少,以及腭突間充質細胞Shh 信號通路下調,隨后在NCCs 衍生的腭突間充質細胞中失去初級纖毛,從而引起嚴重的顱面缺陷,包括雙側唇腭裂和舌發育不全。 最近,有研究揭示IFT122 是IFT-A 的中心樞紐[20]。 國內有學者為闡明IFT122 對PC、Shh 信號通路以及小鼠胚胎腭突間充質細胞(mouse embryo palatal mesenchymal cells, mEPMCs) 增殖的影響,采用RNAi 技術敲減了PC 中IFT122 的表達觀察PC 的生長情況;并檢測Smo、Gli3、細胞增殖標志物(PCNA)和細胞周期因子(Cyclin D1)的表達變化以及mEPMCs 的數量變化;結果顯示缺乏IFT122 組中PC 的發生率降低且長度變短,并且Gli3、Smo、Cyclin D1 及PCNA 的表達低于IFT122 正常組,同時,缺乏IFT122 組中mEPMCs 的數量增長速度減緩。 該研究表明IFT122 通過介導Shh 信號通路參與調控mEPMCs 增殖,同時也間接反映了PC 及其介導的Shh 信號通路在小鼠腭部發育中發揮了至關重要的作用[32]。

3.2 Wnt 信號通路

Wnt 信號通路是腭部組織發育的重要通路之一。 有研究表明,Wnt 信號通路的幾個核心成分均定位于初級纖毛,初級纖毛可參與調控Wnt 信號通路[33-34]。 根據分子機制的不同,Wnt 信號傳導通路主要分為兩種:Wnt/β-catenin 信號通路和Wnt/PCP信號通路。 在Wnt/β-catenin 信號通路中,Wnt 配體與Frizzled(FZD)受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL receptor related protein,LRP)輔助受體的結合而被激活,LRP 受體隨后被酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α, CK1α)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β) 磷 酸 化, 并 激 活Dishevelled(Dsh/Dvl)蛋白質以抑制GSK3 破壞復合物的活性,促進細胞質β-catenin 的穩定,從而進入細胞核調節靶基因的表達,影響細胞的增殖、分化和存活[35]。 Wnt-PCP 信號通路主要調節細胞形態、遷移和定向細胞分裂,并依賴于大量受體組合和下游信號事件[35]。

盡管有研究表明初級纖毛在調節Wnt 信號轉導中發揮作用,但其在Wnt 信號中的作用仍存在爭議。 小鼠胚胎缺乏纖毛微管-驅動蛋白KIF3A,可導致Wnt/β-catenin 信號的異常激活,并且,在缺乏關鍵纖毛發生基因(KIF3A、IFT 88 或OFD1)的小鼠胚胎成纖維細胞中,初級纖毛的丟失與Wnt3a 配體的異常有關[36]。 這些發現支持了初級纖毛抑制Wnt/β-catenin 信號的觀點。 另一項研究表明,具有KIF3A、IFT88、IFT72 突變的小鼠胚胎成纖維細胞表現 出 正 常 的Wnt/β-catenin 信 號 活 性[37]。 Tian等[31]發現,在Wnt1Cre-IFT88fl/fl小鼠腭突間充質中,纖毛細胞的比例及纖毛長度減少,Wnt 信號活性升高,這表明初級纖毛對Wnt 信號通路起著抑制作用。 該研究還發現,在Wnt1Cre-IFT88fl/fl小鼠中,Axin2 在小鼠腭突間充質口腔側的表達水平升高,這提示在腭裂發生過程中,IFT88 介導的纖毛缺陷也可能影響典型的Wnt 信號通路。 非典型的Wnt信號相關分子在腭皺褶發育過程中表現出動態的時空表達模式。 在IFT88 突變小鼠中,ROR2 的表達下調。 這表明初級纖毛參與了腭皺紋發育過程中非典型的Wnt 信號的調節[38]。 此外,Yuan 等[28]發現PC 所調控的Wnt 信號和Hedgehog 通路可共同介導小鼠胚胎腭突上皮與間充質之間相互作用。該研究發現KIF3A 缺失可導致小鼠胚胎腭突間充質中同一區域的Wnt 信號異常增高以及Hedgehog信號異常降低,這種異常的分子信號導致了異常的細胞增殖,進而影響小鼠腭突上皮/間充質的轉換,從而引起腭部畸形。

3.3 Shh 信號通路

有文獻報道,Shh 通過Smo 向腭突間充質傳遞信號,并通過正反饋環調節成纖維細胞生長因子10(fibroblast growth factor 10,Fgf10)的表達,以調控腭部上皮和間質的增殖[39]。 Shh 信號在腭間充質中激活或維持幾種轉錄因子,包括Foxf1、Foxf2、Bmp2和OSR2。 OSR2 是mEPMCs 增殖的內在調節因子,其在mEPMCs 中的表達還依賴于Pax9 轉錄因子的功能。 在OSR2 和Pax9 缺失的胚胎中可出現非綜合征性腭裂,并且Fgf10 在發育中的腭間充質中的表達顯著減少,表明這些轉錄因子通過Shh 和Fgf10信號通路在基因調控腭發育網絡中發揮作用[40]。值得注意的是,最近的遺傳研究揭示了一種新的Shh-Foxf1/2-Fgf18-Shh 分子回路,即Foxf1 和Foxf2是Shh 和FGF 之間腭部調控反饋環的一個重要部分,Shh 依賴Foxf1/2 激活Fgf18,Fgf18 反饋調節Shh 的表達,這對腭突的生長發育至關重要。Foxf2-/-小鼠胚胎可異位激活腭突間充質特定區域Fgf18 的表達并使腭上皮對應區域的Shh 表達異常,從而導致腭突生長障礙[41]。

Msx1 激活腭突間充質中的Bmp4,并向上皮發出信號,激活Shh 信號通路,隨后,Shh 反過來向腭突間充質發出信號,激活Bmp2,控制腭突間充質細胞的增殖,并積極調節Msx1 和Bmp4[42]。 因此,Msx1 基因敲除的小鼠表現出腭裂表型以及腭部Bmp2 和Shh 表達異常,而補充Bmp4 可以恢復Bmp2 和Shh 的表達[43]。 有學者研究利用Hedgehog信號功能增強的小鼠模型K14-Cre-R26SmoM2,揭示Shh 信號在腭部融合過程中腭部上皮中的作用,詳細的組織學分析顯示,新生(出生后第0.5 天)K14-Cre-R26SmoM2 小鼠出生后不久死亡,并表現出嚴重的腭部融合缺損,其原發腭突未能與繼發腭突融合,鼻中隔也未能與腭突融合,中線前后部有一條半透明的條帶,而且繼發腭前部有持續性的正中嵴上皮細胞(medial edge epithelium,MEE),以及分隔腭骨的薄薄的上皮條索,阻礙了雙側腭突沿中線的融合。 這些數據表明,在腭部發生過程中,MEE 特別需要下調Shh 信號,以確保正常的腭部融合[44]。

上述研究表明與小鼠腭發育相關的很多信號因子均與Shh 信號通路有交互作用,而Shh 信號的傳導依賴于PC,故可間接反映這些信號因子在小鼠腭突中的傳遞也與PC 有密切聯系。

4 總結與展望

隨著對初級纖毛的Hedgehog 信號通路和Wnt信號通路影響認識的不斷加深,初級纖毛及相關信號通路調控腭裂發生的機制已逐漸成為焦點研究領域。 目前,雖然部分研究已經明確Hedgehog 信號通路及非經典Wnt 信號通路依賴于纖毛參與腭部發育過程中細胞增殖、存活、遷移等的調控,然而,初級纖毛與Wnt 信號通路的關系仍存在爭議,且腭裂發生的每一步的作用和作用機制,我們還遠未完全了解。 腭發育中的其它重要信號通路如Notch、TGF-β 與纖毛的關系尚不明確,Hedgehog 信號通路與其他信號通路之間是否存在串擾尚不清楚。 我們還需更多的研究來闡明這種初級纖毛及相關信號通路在腭發育中的復雜機制,從而為理解腭裂的發病機制提供重要依據。