lncRNA MACC1-AS1通過靶向miR-429表達對阿爾茨海默病細胞模型損傷的影響

劉少華 張向陽 朱琳 劉典英( 贛州市第三人民醫院心理科,江西 贛州 4000; 中國科學院心理研究所; 贛州市第三人民醫院司法鑒定室)

全世界阿爾茨海默病(AD)發病例數大約為3.6 億,研發AD 治療的新靶點及新思路成為亟待解決的問題,證據顯示長鏈非編碼RNA(lncRNA)在調控基因表達中發揮重要作用,可參與多種生物學過程,異常表達的lncRNA 可參與腫瘤等多種疾病發生及發展過程,在大腦發育或生理病理過程中lncRNA 表達異常,其與AD、帕金森病等多種神經退行性疾病密切相關〔1～4〕。lncRNA MACC1-AS1(簡稱MACC1-AS1)在缺氧誘導的微血管內皮細胞損傷中表達下調,上調其表達可抑制細胞凋亡和氧化損傷,促進細胞增殖〔5〕。靶基因預測顯示miR-429 與MACC1-AS1 存在結合位點,miR-429 在氧-葡萄糖剝奪/復氧(OGD/R)誘導的神經元損傷中高表達,下調其表達可抑制OGD/R 誘導的神經元損傷〔6〕。MACC1-AS1 和miR-429 在AD 細胞模型損傷中的表達及其對AD 細胞模型損傷的影響尚未可知。因此,本研究采用β-淀粉樣蛋白25～35(Aβ25～35)誘導人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH 建立AD 細胞模型,探討MACC1-AS1/miR-429 在AD 細胞模型中的表達及其對細胞氧化應激及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 美國Sigma-Aldrich 公司提供Aβ25～35;人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH,武漢普諾賽;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化酶(GSH-Px)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;凋亡檢測試劑盒,美國Abcam 公司;Trizol試劑,美國Gibco 公司;反轉錄試劑與SYBR 試劑,大連寶生物工程有限公司;Lipofectamine2000,北京索萊寶科技有限公司;pcDNA,美國Invitrogen 公司;上海吉瑪制藥技術有限公司提供miR-NC、miR-429 mimics、si-NC、si-MACC1-AS1、anti-miR-NC、antimiR-429;美國Santa Cruz 公司提供兔抗人B 細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相關X 蛋白(Bax)抗體;武漢博士德生物提供二抗。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 SK-N-SH 細胞(1×105個/ml)接種于96 孔板(100 μl/孔),分別加入含有濃度為5 μmol/L Aβ25～35的培養液內培養24 h〔7〕為AD 組。同時將正常培養的SK-N-SH 細胞為Con 組。Opti-MEM 減血清培養基與pcDNA、pcDNA-MACC1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-429、pcDNA-MACC1-AS1 與miR-NC、pcDNA-MACC1-AS1 與miR-429 mimics 混合后室溫孵育5 min(A 液),Lipofectamine2000 轉染試劑與改良基本成分營養基(Opti-MEM)減血清培養基充分混合(B 液),A 液與B 液充分混勻后室溫孵育20 min,并將其加入SK-N-SH 細胞,轉染6 h 棄上清液后更換為正常培養液繼續培養48 h,收集轉染后的SK-N-SH 細胞加入含有濃度為5 μmol/L Aβ25～35的培養液內培養24 h,分別為AD+pcDNA組、AD+pcDNA-MACC1-AS1 組、AD+anti-miR-NC組、AD+anti-miR-429 組、AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 組、AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-429 組。

1.2.2 qRT-聚合酶鏈反應(PCR) 檢測細胞中MACC1-AS1、miR-429 的表達水平 采用Trizol 法提取各組SK-N-SH 細胞總RNA,反轉錄后得到cDNA。采用SYBR 試劑檢測各組細胞中MACC1-AS1、miR-429 的相對表達量,采用2-ΔΔCt法計算MACC1-AS1、miR-429 的表達水平。

1.2.3 檢測MDA、SOD、GSH-Px 水平 采用反復凍融法裂解細胞,用硫代巴比妥酸法檢測MDA 水平,用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 水平,用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法測定GSH-Px 水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組SK-N-SH 細胞加入2.5 ml/L 含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶消化細胞,棄胰蛋白酶消化液,加入培養液充分混勻后置于離心管內,經3 000 r/min 轉速離心5 min 后棄上清,加入預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞(2.5×104個/ml),相同條件下離心后棄上清,加入1 ml 預冷PBS 后再次離心、棄上清,加入200 μl 結合緩沖液懸浮細胞,按照凋亡檢測試劑盒說明書操作檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測靶向關系 Lnc-Base Predicted v.2 預測顯示MACC1-AS1 與miR-429 存在結合位點,miR-NC、miR-429 mimics 分別與WT-MACC1-AS1、MUT-MACC1-AS1 共轉染入SK-NSH 細胞后繼續培養24 h,收集細胞并檢測相對熒光素酶活性。

1.2.6 Western 印跡檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達 取各組SK-N-SH 細胞后棄培養液,提取總蛋白并進行蛋白定量,取適量蛋白樣品加入上樣緩沖液后沸水浴10 min 蛋白變性,取蛋白樣品(20 μg/孔)經過電泳轉移至PVDF 膜,使用TBST 洗滌后加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入1 ∶1 000 稀釋的一抗后4℃條件下孵育24 h,加入二抗(1 ∶10 000)后室溫孵育1 h,滴加電化學發光(ECL)液顯影,應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 在AD 細胞模型損傷中的表達 與Con 組比較,AD 組MACC1-AS1 表達水平降低,miR-429 表達水平升高,差異均有統計學意義(P＜0.05),見表1。

表1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 AD細胞模型損傷中的表達(±s,n=9)

表1 lncRNA MACC1-AS1 和miR-429 AD細胞模型損傷中的表達(±s,n=9)

組別MACC1-AS1miR-429 Con 組1.00±0.071.00±0.05 AD 組0.45±0.033.23±0.27 t 值P 值21.666 0.000 24.364 0.000

2.2 lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型氧化應激的影響 與Con 組比較,AD 組MDA 水平升高,SOD、GSH-Px 水平降低,差異均有統計學意義(P＜0.05);與AD+pcDNA 組比較,AD+pcDNAMACC1-AS1 組MDA 水平降低,SOD、GSH-Px 水平升高,差異均有統計學意義(P＜0.05),見表2。

表2 lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型氧化應激及凋亡的影響(±s,n=9)

表2 lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型氧化應激及凋亡的影響(±s,n=9)

與Con 組比較:1)P＜0.05;與AD+pcDNA 組比較:2)P＜0.05

組別MACC1-AS1 MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白Con 組1.00±0.043.82±0.2964.15±4.3649.97±3.425.97±0.380.74±0.040.14±0.02 AD 組0.48±0.041)31.93±2.891) 16.39±1.331) 13.73±1.091) 26.27±2.131)0.31±0.031)0.58±0.031)AD+pcDNA 組0.45±0.0334.33±3.0515.48±1.2812.60±1.1927.59±2.410.28±0.030.59±0.04 AD+pcDNA-MACC1-AS1 組 0.85±0.062)5.53±0.492)52.44±5.042) 37.94±3.322)9.76±0.842)0.65±0.042)0.20±0.022)F 值P 值348.000 0.000 543.326 0.000 467.605 0.000 483.840 0.000 398.243 0.000 394.800 0.000 633.000 0.000

2.3 lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型凋亡的影響 與Con 組比較,AD 組細胞凋亡率及Bax 蛋白表達量升高,Bcl-2 蛋白表達降低,差異均有統計學意義(P＜0.05);與AD+pcDNA 組比較,AD+pcDNA-MACC1-AS1 組細胞凋亡率及Bax 蛋白表達量降低,Bcl-2 蛋白表達升高,差異均有統計學意義(P＜0.05),見表2、圖1、圖2。

圖1 各組凋亡相關蛋白表達

圖2 各組細胞凋亡流式圖

2.4 lncRNA MACC1-AS1 靶向調控miR-429 的表達 MACC1-AS1 與miR-429 存在結合位點,見圖3。miR-429 過表達可降低野生型載體WT-MACC1-AS1的熒光素酶活性,差異具有統計學意義(P＜0.05),見表3。轉染pcDNA-MACC1-AS1 可降低miR-429表達量(1.00±0.06 vs 0.45±0.03),轉染si-MACC1-AS1 可增高miR-429 的表達水平(0.99±0.05 vs 3.04±0.23),差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗(±s,n=9)

表3 雙熒光素酶報告實驗(±s,n=9)

組別WT-MACC1-AS1MUT-MACC1-AS1 miR-NC 組1.04±0.081.01±0.09 miR-429 組0.52±0.041.02±0.07 t/P 值17.441/0.0000.263/0.796

圖3 MACC1-AS1 的序列中含有與miR-429 互補的核苷酸序列

2.5 干擾miR-429 表達對AD 細胞模型損傷的影響 與AD+anti-miR-NC 組比較,AD+anti-miR-429組MDA 水平降低,SOD、GSH-Px 水平升高,細胞凋亡率及Bax 蛋白表達量降低,Bcl-2 蛋白表達升高,差異均有統計學意義(均P＜0.05),見圖4、表4。

表4 干擾miR-429 表達對AD 細胞模型損傷的影響(±s,n=9)

表4 干擾miR-429 表達對AD 細胞模型損傷的影響(±s,n=9)

組別miR-429MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白AD+anti-miR-NC 組1.00±0.0435.95±2.7214.82±1.2411.86±1.1728.62±2.030.27±0.030.60±0.04 AD+anti-miR-429 組0.32±0.028.66±0.5443.74±4.1129.24±2.4510.82±1.020.61±0.040.26±0.02 t 值P 值45.616 0.000 29.523 0.000 20.210 0.000 18.204 0.000 23.505 0.000 20.400 0.000 22.808 0.000

圖4 干擾miR-429 表達對AD 細胞模型凋亡的影響

2.6 上調miR-429 表達逆轉了lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型損傷的作用 與AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 組比較,AD+pcDNAMACC1-AS1+miR-429 組細胞凋亡率、MDA 水平、Bax 蛋白表達顯著升高,SOD、GSH-Px 水平、Bcl-2 蛋白表達顯著降低(P＜0.05),見圖5、表5。

圖5 上調miR-429 表達逆轉了lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型凋亡的作用

表5 上調miR-429 表達逆轉了lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型損傷的作用(±s,n=9)

表5 上調miR-429 表達逆轉了lncRNA MACC1-AS1 過表達對AD 細胞模型損傷的作用(±s,n=9)

組別miR-429MDA(μmol/L) SOD(U/mg) GSH-Px(U/mg) 凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-NC 組 1.00±0.055.42±0.4453.01±4.11 39.27±3.019.81±0.770.67±0.050.19±0.02 AD+pcDNA-MACC1-AS1+miR-429 組 2.96±0.2223.91±2.08 27.32±2.14 22.51±2.15 20.53±2.030.33±0.020.48±0.03 t 值26.06326.09116.63213.59314.81318.94124.129 P 值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

3 討 論

AD 的發病機制較為復雜,主要特征為漸行性神經元缺失、功能性記憶缺失,Aβ 沉積是促使AD發生的重要原因,Aβ 沉積可促進神經細胞內微管Tau 蛋白磷酸化從而促進神經元細胞凋亡,lncRNA在AD 發生過程中可發揮重要調控作用,其作用機制與競爭性結合miRNA 密切相關,lncRNA NEAT1通過靶向miR-107 而加重AD 神經元損傷〔8〕。沉默lncRNA XIST 可通過miR-124 而抑制AD 的發展進程〔9〕。抑制lncRNA ATB 可通過調節miR-200/ZNF217 軸而抑制Aβ25～35誘導的神經細胞神經毒性〔10〕。MACC1-AS1 在胰腺癌、肝癌等腫瘤中呈高表達,并可促進細胞增殖及轉移〔11,12〕。但MACC1-AS1 在AD 細胞模型損傷中的表達及其作用機制尚未可知。本研究結果提示,MACC1-AS1 在AD 細胞模型損傷中可能發揮重要調控作用。機體受到感染或疾病等的影響時會促使氧化/抗氧化系統失衡最終造成組織或細胞損傷,SOD、GSH-Px 屬于抗氧化酶,其可清除氧自由基或氧化應激產物從而保護神經細胞,MDA 屬于促氧化酶,其可促進氧化應激發生〔13〕。本研究結果提示,MACC1-AS1 過表達可抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激從而減輕AD 神經細胞損傷。氧化應激是AD 細發病與神經細胞凋亡的主要原因,Aβ25～35可通過促進Bax 的表達及抑制Bcl-2 的表達從而促進細胞凋亡進而造成神經細胞損傷〔14〕。本研究結果顯示,Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞凋亡率升高。

為進一步探究MACC1-AS1 在AD 發生過程中的作用機制,本研究證實MACC1-AS1 可充當miR-429 競爭性內源RNA 分子。miR-429 下調表達通過增加Notch1 表達而抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡〔15〕。miR-429 調節肺泡巨噬細胞炎性細胞因子的產生,并參與LPS 誘導的急性肺損傷〔16〕。抑制miR-429 可以改善顱腦損傷小鼠的神經功能,并減輕小神經膠質神經炎癥〔17〕。本研究結果提示,抑制miR-429 表達可抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激及凋亡從而減輕AD 神經細胞損傷。同時,本研究采用MACC1-AS1 過表達與miR-429 過表達聯合作用于Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞,結果提示miR-429 過表達可逆轉MACC1-AS1 過表達對Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激及凋亡的作用。

綜上,MACC1-AS1 過表達可通過下調miR-429而抑制Aβ25～35誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激及凋亡從而減輕AD 神經細胞損傷,MACC1-AS1/miR-429 可能作為AD 治療的潛在靶標,還可為進一步闡釋AD 的發病機制奠定實驗基礎。但AD 發生過程中MACC1-AS1/miR-429 軸如何調控下游靶基因表達及相關信號通路表達仍需進一步探究。