USP9X基因表達下調對胃癌AGS細胞株增殖和細胞周期的影響

張彩鳳 張超群 杜學芳 夏永華 張利利(新鄉醫學院第一附屬醫院 消化內科,河南 新鄉 45300; 皮膚科)

泛素化通過調控泛素與去泛素化酶(DUBs)而參與多種蛋白功能的調控〔1,2〕,其中以泛素特異性肽酶(USPs)作用最為顯著〔3〕。X 染色體連鎖的泛素特異性肽酶-9(USP9X)作為USPs 家族成員之一,在不同的腫瘤中發揮癌基因或抑癌基因的作用〔4～8〕。USP9X 在胃癌組織中呈現高表達,其表達與淋巴結轉移、遠端轉移和腫瘤分期等密切相關,且USP9X 高表達能降低胃癌患者總生存率,是胃癌患者獨立的不良預后因子〔9〕。然而,USP9X 如何調控胃癌發生發展的病理生理過程尚不明確。因此,本研究探討USP9X 在人胃癌組織中的表達水平,同時采用USP9X siRNA 轉染人胃癌細胞株AGS,分析其表達下調后對人胃癌細胞增殖和周期的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本 隨機選擇新鄉醫學院第一附屬醫院消化內科5 例胃癌患者癌組織,5 例非胃癌患者行胃鏡檢查時獲取的正常胃黏膜組織,組織標本均保存于液氮中備用,且組織標本均經過組織病理學證實。本研究所用組織標本均得到患者及家屬同意,且簽署知情同意書。

1.2 實驗材料 細胞培養基RPMI1640 購自美國Life Technologies 公司;胎牛血清購自美國HyClone公司;鏈霉素和青霉素及CCK-8 試劑盒均購自中國碧云天生物科技有限公司;USP9X siRNA 及其對照siRNA 購自美國Santa Cruz 公司;脂質體2000 購自美國Invitrogen 公司;反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司;USP9X 和β-actin 抗體購自美國Abcam 公司;碘化丙啶購自美國Sigma 公司。

1.3 細胞培養 人胃癌細胞株AGS、SGC-7901 和BGC-823 及人胃正常上皮細胞株GES-1 均從中國科學院上海細胞庫購買。細胞培養液為:RPMI1640(Life Technologies,Grand Island,New York,USA)、10% 胎牛血清(Hyclone Laboratories,Logan,UT,USA)、100 μg/ml 的鏈霉素和100 U/ml 的青霉素,置于含有5%CO2并恒溫37℃的培養箱中培養。

1.4 USP9X siRNA 轉染及分組 當AGS 細胞融合度達到90%左右,將USP9X siRNA 及其對照siRNA(美國Santa Cruz 公司)按照脂質體2000 說明書進行轉染操作,并于轉染后的48 h 進行相關實驗。實驗細胞分為3 組:AGS 組(AGS 細胞未經過特殊處理)、對照siRNA 組(對照siRNA 轉染的AGS 細胞)和USP9X siRNA 組(USP9X siRNA 轉染的AGS細胞)。

1.5 RT-qPCR 從胃癌組織、正常胃黏膜組織及各個不同轉染的胃癌AGS 細胞中提取總RNA,并反轉錄成cDNA,以cDNA 為模板,利用實時熒光定量PCR 特定的試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將各個不同的組分加入至反應體系中,擴增USP9X特定的引物正義鏈: 5′-CATGGACCTGGCTCTCAGTG-3′,反義鏈:5′-AAACACATGGGGACTTCGCT-3′,產物大小為220 bp,擴增內參β-actin 引物正義鏈:AACTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,反義鏈:GGATAGCACAGCCTGGATAGCA-3′, 產物大小為192 bp。USP9X 基因的相對表達水平應用2-ΔΔCt來計算。

1.6 Western 印跡 提取胃癌細胞和組織中的總蛋白,轉膜、封閉后加入一抗(USP9X 和β-actin)、二抗,隨即采用電化學發光(ECL)液曝光使其顯示出特定的蛋白條帶,目的蛋白相對表達的水平=目的蛋白的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.7 細胞增殖 把不同組經過處理的胃癌AGS 細胞接種入96 孔板中,每孔2 000 個細胞左右。根據CCK-8 試劑(中國碧云天生物工程有限公司)說明書,檢測不同時間點胃癌AGS 細胞的增殖水平。最后應用GraphPad Prism6.0 軟件生成AGS 細胞的增殖曲線。

1.8 細胞周期 收集不同組經過處理的胃癌AGS細胞(1×106個左右/組)。經離心后把預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)加入細胞中漂洗,漂洗3 次,應用70%冰乙醇4℃溫度下固定細胞30 min,接著采用預冷的PBS 漂洗細胞3 次,然后將細胞重懸于含40 μg碘化丙啶和100 μg 核糖核酸酶(RNase)A 的PBS緩沖液里,在37℃條件下孵育30 min。應用流式細胞儀檢測不同組經過處理的AGS 細胞中的DNA含量。

1.9 統計學處理 采用SPSS17.0 軟件進行t檢驗、One-way ANOVA 分析。

2 結 果

2.1 USP9X mRNA 在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達水平 5 例胃癌組織中USP9X mRNA 的相對表達水平分別為(2.679±0.139,4.100±0.396,1.743±0.156,3.67±0.338 和5.403±0.510)高于正常胃黏膜組織分別為(1.008±0.021,1.017±0.044,1.007±0.034,1.002±0.020 和1.012±0.025),且表達水平差異具有統計學意義(t=20.600、13.400、8.004、13.660、14.890;P＜0.001,P＜0.01)。

2.2 USP9X 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達 5 例胃癌組織中USP9X 蛋白的相對表達水平分別為(2.347±0.166,1.689±0.187,1.032±0.160,0.462±0.065 和2.485±0.178)高于正常胃黏膜組織(0.225 ±0.035,0.328 ±0.025,0.327 ±0.012,0.022±0.011 和0.055±0.014),差異存在統計學意義(t= 21.69、12.49、7.60、11.52、23.56;P＜0.001,P＜0.01)。見圖1。

圖1 Western 印跡檢測隨機選擇5 例胃癌組織(T)和對應的正常胃黏膜組織(N)中USP9X 蛋白的表達

2.3 USP9X mRNA 和蛋白在胃癌細胞株中的表達

胃癌細胞株 AGS、SGC-7901 和 BGC-823 中USP9X mRNA 表達水平(6.380 ±0.730,4.153 ±1.011 和2.70±0.357)均明顯高于正常胃黏膜細胞GES-1(1.006±0.032,t=12.740、5.391、8.189;P＜0.001,P＜0.01)。胃癌細胞株AGS、SGC-7901 和BGC-823 中USP9X 蛋白表達水平(3.176±0.189,2.304±0.203 和1.446±0.093)均明顯高于正常胃黏膜細胞GES-1(0.232±0.046;t=26.22、17.27、20.28;均P＜0.000 1)。見圖2。

圖2 USP9X 蛋白在不同的胃癌細胞株和正常胃黏膜細胞株的表達

2.4 USP9X siRNA 顯著下調胃癌AGS 細胞株中USP9X 蛋白的表達 與AGS 組(1.002±0.073)及對照siRNA 組(1.036±0.085)相比較,USP9X siRNA 組USP9X 蛋白相對表達量明顯下調(0.040±0.014;F=225.671,P＜0.000 1),AGS 組和對照siRNA 組USP9X 蛋白的相對表達量無顯著差異(t=0.458,P=0.671)。見圖3。

圖3 USP9X siRNA 明顯下調胃癌AGS 細胞中USP9X蛋白的相對表達量

2.5 USP9X 表達下調顯著抑制胃癌AGS 細胞的增殖 CCK-8 結果顯示,與AGS 組和對照siRNA 組相比,USP9X siRNA 組24、48、72、96 h 細胞增殖顯著被抑制(P＜0.05),AGS 組與對照siRNA 組相比較,增殖能力無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖情況比較(±s,n=3)

表1 各組不同時間細胞增殖情況比較(±s,n=3)

與USP9X siRNA 組比較:1)P＜0.05

組別0 h24 h48 h72 h96 h AGS 組0.216±0.0050.553±0.0651)0.824±0.0911)1.204±0.1221)1.583±0.1781)對照siRNA 組0.215±0.0060.603±0.0971)0.876±0.1631)1.203±0.1891)1.683±0.1881)USP9X siRNA 組0.216±0.0050.248±0.0060.452±0.0830.638±0.0930.904±0.066

2.6 USP9X 表達下調顯著改變胃癌AGS 細胞周期分布 流式細胞術檢測結果顯示,USP9X siRNA 組〔(63.39±0.85)%〕中胃癌AGS 細胞在G0/G1 期細胞數的比率高于未處理組〔(54.61±0.70)%〕及對照siRNA 組〔(53.87±1.59)%〕,差異存在統計學意義(F=67.739,P＜0.000 1)。USP9X siRNA 組AGS細胞S 期〔(23.68±0.56)%〕及G2/M 期〔(12.93±1.03)%〕細胞數的比率低于未處理組〔S 期為(29.44±1.98)%,G2/M 期為(15.95±1.38)%〕及對照siRNA 組〔S 期為(28.43±1.63)%,G2/M 期為(17.70±0.24)%〕,其差異存在統計學意義(S 期:F=12.399,P= 0.007,G2/M 期:F= 17.261,P=0.003)。

3 討 論

泛素化屬于蛋白修飾中最為常見的一種形式,能調控細胞增殖、細胞周期、DNA 損傷修復和跨膜運輸等多種不同的細胞生物學過程〔10〕。USP9X 作為一個去泛素化酶,能有效調控細胞的增殖及信號轉導,在多種腫瘤的發病機制中扮演了重要作用〔11,12〕。Wang 等〔13〕實驗證實,USP9X 基因在非小細胞肺癌的癌組織中表達量明顯上調,且USP9X 基因的高表達與淋巴結轉移、臨床分期和總生存率下降關系密切。Zhou 等〔14〕證實USP9X 在急性B 細胞型淋巴細胞性白血病細胞系和患者中均出現過表達現象。此外,轉錄因子E26 相關基因(ERG)陽性的前列腺癌中USP9X 表達水平顯著高于ERG 陰性和良性病變〔15〕。因此,上述結果均證實USP9X 基因在多種腫瘤中發揮癌基因的作用。本文結果與Fu等〔9〕研究結果基本一致,提示USP9X 基因可能在胃癌的發生發展中扮演了重要作用。

研究發現,USP9X 基因在多種腫瘤的細胞增殖及細胞周期的調控中作用顯著,Yang 等〔16〕通過應用RNA 干擾技術下調神經膠質瘤細胞USP9X 表達水平,結果發現USP9X 表達下調能明顯抑制神經膠質瘤U251 和A172 細胞的增殖,并阻止其G1 期向S 期的轉化,同時阻斷原發性神經膠質瘤的腫瘤形成過程。Hu 等〔17〕也證實USP9X 基因表達下調顯著抑制肝癌細胞的細胞增殖和細胞遷移,并促進其凋亡過程。此外,在急性B 細胞型淋巴細胞性白血病的研究中,Zhou 等〔14〕發現USP9X 的敲除顯著抑制細胞的增殖,增加細胞凋亡。本研究結果提示USP9X 在胃癌細胞的增殖和周期調控中發揮重要作用,但是確切的分子機制尚有待進一步探討。

綜上,胃癌組織中USP9X 呈現高表達,USP9X特異的siRNA 能顯著下調胃癌細胞中USP9X 蛋白的表達,顯著抑制胃癌細胞的增殖,并靜止細胞周期在G0/G1 期。這些結果表明,USP9X 可能在胃癌中發揮癌基因的作用,并且對胃癌細胞的增殖和周期具有十分重要的調控作用,因而未來從分子水平進一步闡明USP9X 在胃癌增殖和周期中的調控作用有望為以USP9X 為靶點的胃癌病人的分子靶向治療奠定基礎。