雌激素受體、芳香化酶、卵黃蛋白原研究進展

常菊花 李少斌 田曉麗

長江大學生命科學學院 湖北荊州 434025

1 生物標志物簡介

簡單的急性毒性試驗不能準確地反映當今環(huán)境污染物的污染現(xiàn)狀，所以低劑量的慢性和亞慢性試驗越來越受到重視。生物檢測包括體內(nèi)試驗(In vivo test)和體外試驗(In vitro test)。通常，體內(nèi)試驗指以活體動物為對象進行環(huán)境污染物的內(nèi)分泌干擾作用的研究。體外試驗的設(shè)計基于大部分內(nèi)分泌干擾物在體內(nèi)的作用機制。魚類經(jīng)常被用生殖或內(nèi)分泌毒理學研究，魚類慢性活體試驗常與生物標志物聯(lián)系起來。目前生物標志物(biomarker)可分效應(yīng)標志物(effect biomarker)、暴露標志物(exposure biomarker)和易感性標志物(susceptibility biomarker)三類。效應(yīng)標志物是指生物暴露于污染物后可測出的生理、生化、行為或其他改變的指標。暴露標志物指測定生物組織、體液或排泄物中吸收的污染物本身、其代謝產(chǎn)物或者與內(nèi)源物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)物。易感性生物標志物是針對不同個體對外源性化合物的生物易感性指標，易感性的形成的一個主要原因是基因的多態(tài)性。

2006年世界自然基金會列出了具有生殖—內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的化學物質(zhì)，農(nóng)藥類環(huán)境激素所占比例最大，其中農(nóng)藥及其代謝物有九十多種。

表1 具有生殖—內(nèi)分泌干擾效應(yīng)農(nóng)藥列表Table1 WWF list of pesticides with reproductive or endocrine disrupting effects

2 硬骨魚雌激素受體

1962年，Jensen等用放射配體結(jié)合分析法(radio ligand binding assay，RU)首先證實了雌激素受體(Estrogen receptor，ER)的存在。ER是一種糖蛋白，分子量約35000～90000，具有特異性強，親和力高，結(jié)合能量低的特性，ER的生物特性極不穩(wěn)定，與雌二醇(E2)結(jié)合后的復(fù)合物則較穩(wěn)定。雌激素受體由三個獨立但又相互影響的功能區(qū)構(gòu)成：氨基末端、DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domain，DBD)和羥基末端的配體結(jié)合區(qū)(1igand binding domain，LBD)。

與高等脊椎動物不同的是，多數(shù)硬骨魚類中ERβ存在異型體，它們分別由兩個不同基因(ERβ1和ERβ2)編碼。硬骨魚類ER種類和生理功能狀況遠比高等脊椎動物復(fù)雜。關(guān)于雌激素受體的研究，硬骨魚遠遠落后于哺乳動物。到目前為止，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、青鳉(medaka)、梭魚(Mugilsoiuy)、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、擬鯉(Rutilusrutilus)、鯰魚(catfish)和黑頭軟口鰷(FatheadMinnow)等雌激素受體序列。黑頭軟口鰷(FatheadMinnow)組織分布分析表明，ERmRNAs在兩性魚類的腦、垂體、肝臟和性腺的表達非常高，在腸、腮和肌肉也有表達。目前雌激素受體的研究主要集中在對雌激素受體的識別、定位、基因克隆、基因表達上，對其三維結(jié)構(gòu)的研究很少。

3 硬骨魚芳香化酶

芳香化酶可以催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素合成中的關(guān)鍵酶。芳香化酶基因是目前了解比較清楚的影響魚類性別的基因，芳香化酶抑制劑可抑制日本褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)P450arom mRNA表達而成為表型雄魚。赤點石斑魚兩種芳香化酶分別由不同的基因編碼。腦芳香化酶(P450aromB)的cDNA全長為1901 bp，編碼509氨基酸；性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA全長為1833 bp，編碼518氨基酸。序列分析結(jié)果表明，赤點石斑魚兩種芳香化酶cDNA序列的同源性為51.6%。芳香化酶可以影響魚類的性腺發(fā)育和性別轉(zhuǎn)化、血清中性類固醇激素含量等。魚腦和垂體中的芳香化酶水平比其他脊椎動物高出100～1000倍。在魚類性別分化和性逆轉(zhuǎn)實驗中，芳香化酶是相對研究較多的一種酶類，它的活性和表達的強弱，在一定程度上可以反映出雌激素的生物合成狀況。目前許多硬骨魚類P450芳香化酶的cDNA已被克隆，這些cDNA編碼的氨基酸序列與兩棲類、鳥類、哺乳類等芳香化酶cDNA編碼的氨基酸序列同源性較高，表明芳香化酶在進化上和功能上相當保守。

4 硬骨魚卵黃蛋白原

卵黃蛋白原是卵黃蛋白的前體，它對魚類的生殖非常重要。肝臟VTG合成過程是下丘腦一垂體一性腺神經(jīng)內(nèi)分泌軸通過環(huán)境或內(nèi)源信號激活下發(fā)生的自然過程。一般只有在性成熟的雌魚體內(nèi)，足夠量的雌激素(17β-雌二醇)作用于肝臟肝細胞膜上的雌激素受體，從而誘導卵黃蛋白原基因表達，產(chǎn)生卵黃蛋白原。隨后VTG進入血液循環(huán)達到卵巢，進入卵母細胞，分解成卵黃脂磷蛋白和卵黃高磷蛋白，用作初生胚胎的營養(yǎng)和能量來源，支持胚胎發(fā)育。卵黃蛋白原只在成熟雌性卵生動物體內(nèi)表達，幼年和雄性動物體內(nèi)則無，但是可以在外源性雌激素誘導其表達。卵黃蛋白原(Vitellogenin)可以考慮作為一個指示環(huán)境內(nèi)分泌干擾物污染的生物標志物。

5 展望

對硬骨魚雌激素、芳香化酶、卵黃蛋白原的結(jié)構(gòu)和功能研究可以進一步為生物標志物的選擇提供理論依據(jù)。