丹參多酚酸鹽對H2O2誘導心肌細胞凋亡與自噬的影響及機制研究*

李兵

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

目前，心血管疾病居我國居民致死疾病譜首位，動脈粥樣硬化所致缺血性心血管疾病、缺血性心肌病是其主要致死原因［1］，氧化應激所致心肌細胞凋亡與自噬是該病進展的重要病理基礎［2-3］。丹參多酚酸鹽（salvianolate，SAL）是中藥丹參的水溶提取物，具有抗氧化、抗炎等多種生物學活性［4-5］，目前臨床上主要用于治療輕、中度穩(wěn)定型心絞痛。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)SAL能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應而對心肌缺血再灌注大鼠起到一定保護作用［6-7］。本實驗以H9c2心肌細胞為研究對象，探討SAL對過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導H9c2心肌細胞凋亡與自噬的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞H9c2心肌細胞（上海中國科學院細胞庫，目錄號：GNR5）。H9c2細胞接種在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次，取第三代對數(shù)生長期H9c2細胞進行實驗研究。

1.2 藥物及試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：SH30019.02）；SAL［上海綠谷制藥有限公司，批號：1903027，規(guī)格：50 mg/瓶（含丹參乙酸鎂40 mg）］；胰酶、胎牛血清（美國Invitrogen公司，批號：S27053、A44382）；青鏈霉素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海源葉生物科技有限公司，批號：D17A8F61375、B11A5C33718）；CCK-8試劑盒、山羊抗兔IgG二抗（北京索萊寶科技有限公司，批號：CK04、SE134）；兔抗鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylation Akt，p-Akt）、半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相 關X蛋 白（Bcl-2 related X protein，Bax）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylation mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）、P62抗體（Abcam公司，批號：ab207316、ab207324、ab186210、ab185436、ab190527、ab203408、ab182714、ab2061118、ab194329）；增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試 劑 盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸（bisquinolinecarboxylic acid，BCA）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0018S、C1075S、P0013C、P0012）。

1.3 實驗儀器HERACell 150i型細胞培養(yǎng)箱（德國Thermo公司）；RT-6100型酶標儀（美國Rayto公司）；ST16R型超速冷凍離心機（美國Beckman公司）；MF52型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；FACS Calibur流式細胞儀、PowerPac HV型電泳儀、Trans-Blot SD型 轉 膜 儀（美 國Bio-Rad公司）；C600型凝膠成像系統(tǒng)（美國Azure公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備［8］取對數(shù)生長期H9c2心肌細胞，經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×105個/mL的單細胞懸液，200 μL/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，更換含有100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h以制備H2O2誘導H9c2心肌細胞氧化損傷模型。

1.4.2 細胞分組設H2O2組和SAL50、100、200 mg/L組；另取對數(shù)生長期H9c2細胞設為正常組。

1.5 觀察指標

1.5.1 H9c2心肌細胞增殖率各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×104個/mL的單細胞懸液，100 μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每組設10個復孔；SAL50、100、200 mg/L組分別加入含50、100、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，10 μL/孔加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后消化并收集細胞，然后通過酶標儀測定570 nm處吸光度（A）。

細胞增殖抑制率（%）=（A藥物組/A正常組）×100%1.5.2 H9c2心肌細胞凋亡率各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度5×105個/mL的單細胞懸液，以200 μL/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每組設10個復孔；SAL 0、100、200 mg/L組分別加入含50、100、200 mg/L的SAL培養(yǎng)液，H2O2組和正常組加常規(guī)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化，以離心半徑8.4 cm，2000 r/min離心5 min收集細胞，按照試劑盒說明，滴加稀釋后的結合緩沖液重懸細胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37℃避光孵育15 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5.3 H9c2心肌細胞自噬小體數(shù)量［8］按照“1.5.2”項方法，各組細胞給藥干預并培養(yǎng)24 h后，更換含有GFP-LC3質(zhì)粒和轉染試劑的培養(yǎng)基（不含胎牛血清），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，通過熒光顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)亮綠色熒光點狀聚集即為自噬小體。

1.5.4 H9c2心肌細胞蛋白表達量各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度1×106個/mL的單細胞懸液，以1 mL/孔接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，每組設10個皿，然后按照“1.5.2”項方法，各組細胞給藥干預并培養(yǎng)24 h后，消化并收集細胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4℃，離心半徑8.4 cm、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后、沸水浴5 min使蛋白完全變性，以30 μg蛋白量上樣進行10%SDSPAGE膠電泳、轉PVDF膜、以5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2 h，分別滴加目標蛋白、β-actin兔抗鼠一抗后4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后滴加山羊抗兔二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后滴加ECL化學發(fā)光液，暗盒中顯影后采用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H9c2心肌細胞增殖率與正常組比較，H2O2組H9c2細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組增殖率顯著升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組H9c2心肌細胞增殖率

2.2 H9c2心肌細胞凋亡率與正常組比較，H2O2組H9c2細胞凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL50、100、200 mg/L組凋亡細胞數(shù)量明顯減少，凋亡率顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2—3。

圖2 各組H9c2心肌細胞凋亡率

圖3 各組H9c2心肌細胞凋亡水平

2.3 H9c2心肌細胞自噬小體數(shù)量結果與正常組比較，H2O2組H9c2細胞內(nèi)自噬小體（亮綠色熒光點狀聚集）數(shù)量明顯增多；與H2O2組比較，SAL50、100、200 mg/L組自噬小體數(shù)量不同程度減少，其中SAL200 mg/L組少于其他組。見圖4。

圖4 熒光顯微下各組H9c2心肌細胞自噬小體（×400）

2.4 H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達及p-Akt/Akt表達量與正常組比較，H2O2組H9c2細胞p-Akt、p-mTOR表達明顯下調(diào)而p-Akt顯著降低（P＜0.01），兩組間Akt表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組H9c2細胞p-Akt、p-mTOR表達明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），p-Akt顯著升高（P＜0.01）。見圖5—6。

圖5 各組H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白表達電泳圖

2.5 H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白表達及bcl-2/Bax、LC3-Ⅱ/LC3-I比值與正常組比較，H2O2組H9c2細胞Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-II、P62蛋白表達明顯上調(diào)而bcl-2表達下調(diào)（P＜0.01），bcl-2/Bax比值降低而LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，SAL100、200 mg/L組H9c2細胞Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-II、P62蛋白表達明顯下調(diào)且bcl-2表達上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），SAL50、100、200 mg/L組bcl-2/Bax比值升高而LC3-II/LC3-I比值降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖7—9。

圖6 各組H9c2心肌細胞Akt、p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量及p-Akt/Akt表達量

圖7 各組H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白表達電泳圖

圖8 各組H9c2心肌細胞Bcl-2/Bax、LC3-II/LC3-I比值

圖9 各組H9c2心肌細胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達量

3 討論

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）代謝失衡，誘導細胞凋亡、自噬，與各類心血管疾病進展密切相關［9-10］，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死以及經(jīng)治療實現(xiàn)再灌注后將引發(fā)ROS大量產(chǎn)生而過剩［11-12］。因此，以細胞凋亡和自噬為治療靶點，對改善心肌細胞氧化應激損傷具有重要意義。

H2O2是細胞生理代謝過程中非常重要的一個中間產(chǎn)物，參與基因轉錄與表達、細胞增殖等細胞生物過程，但過量的H2O2將會誘發(fā)胞內(nèi)氧化應激反應，進而誘發(fā)細胞凋亡與自噬［13］。丹參以唇形科植物丹參的干燥根和根莖入藥，味苦、性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰之功效，臨床用于胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、痛經(jīng)閉經(jīng)等癥的治療。SAL為丹參的水溶提取物，具有良好的抗氧化活性［4，14］，目前臨床上主要用于輕、中度穩(wěn)定型心絞痛的治療。本實驗采用H2O2干預制備H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，給予不同濃度SAL進行干預發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯提高H9c2細胞增殖率并降低凋亡率，減少細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量，提示SAL對H2O2所致H9c2細胞氧化應激損傷后凋亡和自噬具有抑制作用。

細胞凋亡和自噬是由基因調(diào)控的兩種程序化自主死亡途徑，參與多種生理、病理過程，對維持細 胞 穩(wěn) 態(tài) 具 有 重 要 作 用［15］。Bcl-2家 族 和Caspase家族蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。在氧化應激等病理性刺激下，Bax上調(diào)表達并轉移到線粒體膜而導致其通透性改變，細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）由線粒體釋放進入細胞質(zhì)，從而激活線粒體凋亡通路［16-17］。Cyt C將激活Caspase-3，活化Caspase-3蛋白被認為是細胞凋亡最重要啟動因子和執(zhí)行者，具有剪切細胞結構蛋白等作用［18］；Bcl-2主要位于線粒體膜，對膜通透性具有保護作用，并且能夠與Bax形成二聚體而抑制Bax活性，所以Bcl-2/Bax表達比值能夠反映Bcl-2家族對細胞凋亡所起到的調(diào)控作用［19］。LC3蛋白具有LC3-I和LC3-Ⅱ兩種亞型，定位于細胞內(nèi)自噬體膜，其中LC3-Ⅱ能夠與線粒體受體蛋白結合而誘導其降解，LC3-I則無具備自噬活性，但自噬發(fā)生后LC3-I將轉化為LC3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ/LC3-I比值能夠反映細胞自噬水平［20-21］。P62能夠誘導靶蛋白泛素化而被自噬體包裹而被降解，能夠通過PB1結構域與非泛素化蛋白聚集體結合而介導其自噬清除，并且P62能夠與LC3蛋白而促進自噬小體的形成［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯下調(diào)H9c2細胞Caspase-3、Bax、LC3-I、LC3-Ⅱ表達并上調(diào)Bcl-2表達，提高bcl-2/Bax比值并降低LC3-Ⅱ/LC3-I比值。

Akt是一種原癌基因，由胞漿移位到脂膜并被磷酸化而激活后，能夠誘導Caspase蛋白磷酸化而失活，抑制Bax蛋白表達［23］。p-Akt能夠誘導下游基因mTOR磷酸化而活化，p-mTOR能夠清除泛素蛋白而抑制細胞自噬，能夠誘導Beclin1蛋白磷酸化而失活，而Beclin1能夠介導LC3等自噬蛋白轉移到自噬體膜的關鍵因子，從而間接促進細胞自噬［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAL干預能夠明顯上調(diào)p-Akt、p-mTOR蛋白表達并提高Akt磷酸化，下調(diào)Beclin1表達，提示SAL對H2O2所致H9c2細胞氧化應激損傷后凋亡、自噬的抑制作用可能與激活Akt/mTOR/Beclin1通路有關。

綜上所述，SAL對H2O2所致H9c2心肌細胞凋亡與自噬具有抑制作用，其機制可能與激活Akt/mTOR/Beclin1通路而抑制促凋亡、促自噬相關蛋白表達和活化有關。