miR-495的生物學功能及與腫瘤關系的研究進展〔1〕

黃靈娟，徐顥

(1.西安醫學院第一附屬醫院，陜西 西安 710077；2.西安醫學院第一附屬醫院全科醫學院，陜西 西安 710077；3.西安市第三醫院，陜西 西安 710077)

微小RNA(miRNA/miR)在人類各種類型的癌癥中均有異常表達，即許多miRNA參與了腫瘤的發生和發展。基于miRNA及其可能調控的靶基因的治療策略，顯著提高了癌細胞對化療藥物的敏感性。然而，眾多miRNA在惡性腫瘤中的作用及發病機制并不明確。人類基因組中14q32.31基因簇上包含許多編碼miRNA的基因，miR-495就是其中之一。它與該基因簇上的miR-299-5p，miR-376a，miR-376c，miR-300，miR-380，miR-494，miR-1197等一樣，具有相似的病理生理調節作用[1]。miR-495分別從pre-miRNA-495的莖環結構的3＇-和5＇-鏈剪切形成miR-495-3p和miR-495-5p，但miR-495在各種腫瘤中的表達情況不盡相同。本文對miR-495在機體正常發育、免疫和炎癥中的作用及其在癌癥中的調節功能作一綜述。

1 miR-495的生物學功能

miRNA通過與其靶基因的3＇非翻譯區不完全或完全互補結合，進而負性調控靶基因的表達，從而在正常生理和病理過程中發揮重要作用。Choi等[2]通過感染小鼠高毒性禽流感H5N2病毒，檢測到有9個miRNA在小鼠體內被上調，其中包括miR-495。最后確定，這些miRNA參與了免疫相關反應、細胞凋亡和禽流感H5N2病毒的復制。miR-495也是人間充質軟骨干細胞分化的重要調節因子，能誘導SRY相關高遷移率族盒基因9(SOX9)的高表達，最終有助于軟骨形成分化[3]。同時，SOX9在軟骨發育中的功能也依賴于miR-495。在炎癥性疾病方面，miR-495與具有核苷酸結合寡聚結構域2(NOD2)基因突變的克隆恩病(CD)的發病機制密切相關。miR-495的過表達導致NOD2表達下降，進而抑制核轉錄因子(NF-κB)活性，并下調白細胞介素8(IL-8)和趨化因子配體3(CXCL3)信使RNA的表達。因此，學者認為，包括miR-495在內的miRNA可能成為有和無NOD2基因突變的CD患者的潛在抗炎治療策略[4]。

2 miR-495與腫瘤

2.1 miR-495與胃癌

胃癌(GC)是最常見的消化系統腫瘤。大多數GC被診斷時已經發現有遠處病灶的轉移。Li等[5]在原發性GC組織中預測了靶向再生肝磷酸酶3(PRL-3)的兩種miRNA，分別是miR-495和miR-551a，兩者均在GC樣本中表達下調。在轉染miR-495和miR-551a模擬物的GC細胞系中，通過實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)和蛋白質印跡技術驗證了這兩種miRNA與PRL-3存在相互作用。轉染miR-495或miR-551a模擬物后，可顯著抑制GC細胞的遷移和侵襲。研究[5]表明miR-495和miR-551a充當腫瘤抑制因子的角色，通過靶向PRL-3癌基因抑制GC細胞遷移和侵襲，進而發揮抑癌作用。在GC腹膜轉移和淋巴結轉移(LNM)患者組織標本中，miR-495也顯著下調。PRL-3被認為與GC的轉移有關。PRL-3是miR-495的下游靶標，miR-495通過上調PRL-3促進GC細胞的運動、侵襲和轉移，進而發揮致病作用。轉染miR-495模擬物可抑制GC細胞的侵襲和轉移。然而，miR-495通過上調靶基因PRL-3的表達而促進GC腹膜轉移的分子調控機制仍有待闡明。有研究[6]采用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鈉測序法檢測miR-495啟動子甲基化狀態，發現用5-Aza-2＇-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理GC細胞系后，miR-495啟動子甲基化失活，顯著抑制GC細胞的遷移和侵襲能力；而miR-495過表達，PRL-3的mRNA和蛋白水平降低，侵襲轉移能力減弱，提示miR-495具有抑癌特性。總之，在GC中miR-495的去甲基化處理，將為預防和治療GC腹膜轉移提供新的策略。

2.2 miR-495與血液系統惡性腫瘤

miRNA被認為是包括白血病在內的所有生物發育過程中的重要表達調節因子。Jiang等[7]通過對85 例人類急性髓系白血病(AML)和15 例正常對照樣本的全基因組miRNA表達譜進行分析，發現在混合系白血病(MLL)和非MLL重排的AML樣本中有48個顯著差異表達的基因，但僅miR-495在MLL中的表達水平低于非MLL重排的AML。該研究表明，造血細胞中miR-495的產生存在MLL融合基因介導的負調控。人和小鼠正常造血干/祖細胞中MLL融合基因的異位表達可以顯著下調miR-495的內源性表達，并且在體外證實miR-495能促進MLL融合基因介導的細胞轉化和體內白血病的發生。骨髓嗜生態病毒整合位點1(MEIS1)和前B細胞白血病同源框轉錄因子3(PBX3)都是MLL融合蛋白的重要下游靶基因，在MLL重排白血病的發生和維持中發揮關鍵的致癌作用。研究[7]表明，PBX3和MEIS1是miR-495的兩個直接靶基因，它們中任何一個的低表達都可以逆轉miR-495過表達所致的細胞活力抑制。因此，miR-495可能作為腫瘤抑制因子在具有MLL重排的AML中發揮作用。此外，miR-495與化療藥物的耐藥有關。據報道，許多位于14q32.31基因簇上的miRNA在抗阿霉素(ADM)耐藥白血病細胞系(K562/ADM)中被下調。在K562/ADM細胞中轉染miR-495模擬物可以下調P-糖蛋白表達，增加對ADM的敏感性。同時發現，miR-495還能增加慢性髓系白血病細胞(CML)的化療敏感性[8]。因此，miRNA-495可能為腫瘤耐藥治療提供了新的可能途徑。

2.3 miR-495與肺癌

miRNA可在轉錄及轉錄后調節肺癌致病基因的表達。已有研究[9]證實，miR-495作為抑癌基因在非小細胞肺癌(NSCLC)中顯著下調；miR-495與肺癌化療藥物耐藥有關。轉運銅的P型三磷酸腺苷A(ATP7A)與NSCLC中的鉑類藥物耐藥性相關。Song等[10]研究小組企圖通過靶向NSCLC中ATP7A探索哪些miRNA可能參與肺癌鉑類耐藥。通過基因芯片和生物信息學分析，篩選出miR-495作為候選miRNA。隨后證實ATP7A是miR-495的直接靶標。藥敏實驗表明，miR-495增強了NSCLC細胞對順鉑的藥效反應，而抑制miR-495則導致相反的效果。除此之外，miR-495能增加細胞內順鉑的積累，而ATP7A的過表達可以降低miR-495誘導的藥物濃度增加，表明miR-495通過調節NSCLC中ATP7A的表達來調節多重耐藥性。miR-495可作為治療多重耐藥NSCLC患者的可能策略[10]。

2.4 miR-495與膠質母細胞瘤

多形性膠質母細胞瘤(GBM)是最具侵襲性的膠質瘤類型，預后差。因此，迫切需要了解膠質瘤發生的機制及治療方法。一項臨床研究[11]發現，在GBM患者中，miR-495呈顯著低水平表達，而細胞周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)被證實為高表達。CDK6的高表達與GBM患者低存活率相關。在GBM T98細胞中發現，miR-495的過表達下調了CDK6的表達。通過小干擾RNA(siRNA)敲低GBM U87-MG和T98細胞中的CDK6，導致細胞周期停滯在G1/S期，繼而抑制細胞增殖。該研究證實了miR-495在膠質瘤組織中表達下調，表明miR-495在腫瘤進展中可能發揮作用，但需要進一步研究來確定miR-495通過降低CDK6表達來抑制膠質瘤細胞增殖的確切機制。

2.5 miR-495與前列腺癌

miRNA的異常表達也與前列腺癌(PCa)進展有關。越來越多的證據確定，miR-495在PCa的發生發展中扮演著抑癌基因的角色。與正常前列腺上皮細胞相比，PCa細胞系中的miR-495表達下降。此外，有研究[12]發現，擴增的miR-495在體外可抑制PCa細胞增殖、遷移和侵襲，并通過抑制AKT和雷帕霉素的靶標(mTOR)顯著延緩體內腫瘤的生長。賴氨酸特異性脫甲基酶5A(KDM5A)作為一種去甲基化酶，可以與miR-495的啟動子區域結合，抑制其轉錄，然后降低其在人PCa細胞中的表達，從而促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移，減少細胞凋亡。既然KDM5A可通過抑制miR-495而促進PCa的惡性進展，那么miR-495在PCa中的潛在作用機制是什么? Du等[13]通過生物信息學分析預測了miR-495和m6A閱讀器蛋白YTH結構域家族成員2(YTHDF2)可能的結合位點，隨后通過雙熒光素酶報告基因等實驗方法證實了miR-495可以靶向YTHDF2并抑制其在PCa細胞中的表達。YTHDF2的過表達可破壞miR-495對PCa細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，進而實現對細胞凋亡的促進作用。為了進一步闡明KDM5A/miR-495/YTHDF2在PCa中的作用機制，研究者應用實時定量PCR技術檢測了PCa組織中抑癌基因mps-結合激酶激活劑3B(MOB3B)mRNA和蛋白的表達情況，發現兩者表達均下降，MOB3B的N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾水平也在降低；多樣本分析認為KDM5A與MOB3B表達存在顯著負相關。最后確定KDM5A可以通過抑制miR-495，上調YTHDF2的表達，下調MOB3B的表達，進而刺激PCa細胞的增殖、遷移和侵襲。隨后裸鼠成瘤試驗也驗證了這一假設[13]。以上結果說明，miR-495作為抑癌基因，在PCa的發生及進展中發揮著重要作用。

2.6 miR-495與乳腺癌

在大多數國家，乳腺癌(BC)是女性發病和死亡的主要原因，發病率呈逐年上升趨勢。研究[14]發現，miRNA-495在許多癌細胞中具有抑癌作用。有研究[15]表明，高甲基化可能是miRNA-495表達抑制的主要原因。在BC細胞中，miR-495基因CpG島的高甲基化導致miR-495沉默和STAT-3表達上調。DNA甲基轉移酶抑制劑5-AzaC能夠逆轉DNA甲基化，導致miR-495表達上調，進而抑制癌細胞在BC中的生長和存活。該研究表明，去甲基化激活miR-495基因的表達可能是人類BC的一種新的聯合療法。除此之外，Alkhathami等[16]研究小組也在BC患者中觀察到miR-495表達下降，且其低表達與軸突蛋白-1(NRXN-1)呈負相關，而NRXN-1和接觸蛋白-1(CNTN-1)表達增加與BC疾病進展和遠處轉移有關。因此，miR-495可能是重要的預測乳腺癌患者疾病進展的標志物。

然而也有研究[17]發現，miR-495在乳腺癌干細胞(BCSCs)中高表達；上調的miR-495能維持BCSCs的表型，并通過抑制E-鈣黏蛋白表達，促進上皮間質轉化(EMT)，導致癌細胞侵襲。在BC臨床標本中證實，miR-495可通過抑制連接黏附分子A(JAM-A)促進乳腺癌的進展。由此可見，miR-495在BC中也可能扮演著促癌基因的角色。與其他腫瘤一樣，乳腺癌的發病機制也與缺氧相關[18-20]。研究[21]發現，miR-495通過靶向DNA損傷誘導轉錄本4(REDD1/DDIT4)基因，抑制其在缺氧時的誘導，從而導致組成性抗缺氧細胞增殖，產生抗腫瘤效應。體內實驗也證實，miR-495在乳腺癌細胞中的異位表達促進了它們在體外的集落形成和小鼠腫瘤的發生。這些發現揭示了一種以miR-495為中心的新的調節途徑，有助于理解BCSCs的特性和缺氧耐受性。

2.7 miR-495與肝癌

肝癌(HCC)是全球第五大常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第二大常見原因。研究[21]發現，miR-495在HCC中呈低表達。上調的miR-495通過降低HCC中甲硫氨酸腺苷轉移酶1A(MAT1A)mRNA的表達促進肝癌細胞的增殖。在HCC小鼠模型中，miR-495的穩定過表達，下調了MAT1A，促進了HCC細胞的侵襲和轉移。Zhang等[22]通過生物信息學預測腫瘤壞死因子相關蛋白3(CTRP3)可能是miR-495的另一潛在靶標。CTRP3可通過轉化生長因子-β1(TGF-β1)刺激腫瘤細胞增殖和遷移。將HCC中低表達的miR-495過表達后，通過直接靶向CTRP3可抑制肝癌細胞的生長。體內實驗表明miR-495可阻止小鼠HCC的進展。與陰性對照組相比，miR-495過表達組小鼠腫瘤體積更小。此外，在miR-495過表達組中觀察到CTRP3表達水平降低三倍以上。體內研究結果與體外一致。該研究充分表明，miR-495有可能成為HCC治療的潛在生物靶標，但局限性在于并未深入探討miR-495靶向CTRP3的作用機制[22]。鋅指蛋白503(ZNF503)在維持正常細胞組織發育和腫瘤發生過程中起關鍵的調節作用。Yin等[23]首次發現ZNF503在HCC組織和細胞中上調，miR-495與ZNF503表達呈負相關。并且證實了ZNF503通過負性調控miR-495的表達，進而調節GATA結合蛋白3(GATA3)啟動子的表達，抑制HCC細胞遷移、侵襲和EMT的過程，這一研究成果表明miR-495間接參與了HCC的發生及發展[23]。Ye等[24]研究發現，miR-495在HCC組織和細胞系中表達下調，且miR-495的表達水平與HCC患者的腫瘤大小、腫瘤分期和淋巴結轉移顯著相關；功能測定顯示miR-495過表達可抑制HCC中的細胞增殖和侵襲。胰島素樣生長因子受體-1(IGF1R)被確定為HCC中miR-495的直接靶基因。IGF1R在HCC組織中上調，與miR-495的表達水平呈負相關。IGF1R上調后可以抑制miR-495的表達，進而促使HCC的進展。相反，過表達miR-495后，IGF1R的表達下降，促進HCC細胞凋亡。研究發現，miR-495通過直接靶向IGF1R并調節AKT和ERK信號通路抑制HCC細胞的增殖和侵襲。這些結果為HCC進展的分子機制提供了新的見解，表明miR-495可作為HCC新的治療靶點[24]。

盡管不少研究認為miR-495在HCC中低表達，但Wang等[25]收集56 例肝細胞癌組織標本(HCC組)和40 例正常肝組織標本(對照組)，通過逆轉錄實時熒光定量PCR技術檢測發現，miR-495在肝癌組織中呈高表達，且后續臨床資料分析發現，其與HCC患者臨床病理特征有一定關系。miR-495 inhibitor處理肝癌MHCC-97H細胞后，其增殖以及遷移能力減弱。這一研究結果與以上miR-495在HCC中低表達的研究結論不符，可能與臨床樣本偏差及實驗技術方法不同等有關。

2.8 miR-495與膽囊癌

一項關于膽囊癌(GBC)的研究發現，PH結構域和富含亮氨酸的重復蛋白磷酸酶(PHLPP)是miR-495的另一靶標[26]。PHLPP被認為是具有很強的細胞凋亡誘導作用。在GBC組織和細胞系中，PHLPP表達降低，miR-495表達升高，促進生存素基因survivin表達增加。PHLPP高表達后可以直接通過促進survivin的磷酸化，或間接通過蛋白激酶B/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路，促進GBC增殖。已經提出miR-495/PHLPP/AKT/survivin抗凋亡信號通路的存在。隨后研究者在裸鼠GBC異種移植模型中發現，增加PHLPP表達或抑制miR-495表達可誘導細胞凋亡并抑制腫瘤生長，并提出了針對miR-495/PHLPP/AKT/survivin調控通路的基因治療策略。

3 展 望

綜上，miR-495在大多數惡性腫瘤中充當抑癌基因的角色，通過調節靶基因的表達，抑制癌細胞的增殖、凋亡及遷移。但在部分腫瘤中也扮演著癌基因的作用，促進腫瘤的發生及進展。miR-495在某些癌癥細胞中上調或下調的原因仍不清楚。盡管一些研究已經明確了miR-495調節靶基因的作用機制，但眾所周知，miRNA與靶基因是一對多或多對一的關系，一個特定的miRNA可以調控多種靶基因，不同靶基因又具有不同的調節作用。因此，miR-495的多靶點調控機制后續仍需進一步在更多的臨床標本、細胞及動物模型中研究。同時，通過miRNA-495拮抗劑或miRNA模擬物糾正其在腫瘤中原本失調的表達可能是一種新的抗癌治療策略。