龍膽苦苷用于治療肝臟疾病的研究進展

孟楊 劉東璞 苗長喻 張輝 邱艷杰

(1佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2黑龍江省微生物-免疫調解網絡與相關疾病重點實驗室；3佳木斯市婦幼保健院)

肝臟疾病主要包括病毒性肝炎、肝膿腫、肝結核、脂肪肝、肝血吸蟲病、肝內膽管結石、肝硬化、肝衰竭和肝癌等。隨著生活水平的提高，我國肝病患者越來越多，特別是肝硬化和肝癌發病率急劇增高〔1〕。雖然在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝病(AFLD)、肝纖維(HF)、肝癌等肝臟疾病領域實驗性研究頗多，但其發病機制仍不明確。由于傳統中草藥提取物具有價格低廉、副作用小、作用廣泛等特點，人們開始嘗試采用中草藥單體治療肝臟疾病。龍膽苦苷(GPS)為一種裂環烯醚萜苷類物質〔2〕，是從龍膽草中提取的天然產物單體，而龍膽草是廣泛用于治療肝臟疾病的代表龍膽瀉肝丸的主要中藥組成之一，其主清熱除燥、入肝膽經，對肝臟有很好的保護作用〔3〕。研究表明GPS能減緩或逆轉肝損傷、NAFLD、酒精性肝炎及肝內膽汁淤積等疾病，其機制主要與降低炎癥反應、抑制氧化應激、調節血脂和增強機體免疫力有關〔4,5〕。本綜述將對GPS在NAFLD、AFLD、HF、肝癌發生、發展中的作用途徑進行總結，旨在為NAFLD、AFLD、HF、肝癌的治療提供新的思路，也為可能開發GPS為保肝藥物奠定基礎。

1 GPS和NAFLD

NAFLD是指無過量飲酒史，而由糖脂等代謝異常引起的脂肪顆粒在肝臟中聚集，最終引起肝細胞脂肪變性的一種臨床病理綜合征〔6〕。伴隨著物質生活的提高和人們飲食布局的調整，NAFLD患者在我國越來越呈現低齡化趨勢，不合理的飲食習慣、熬夜、缺乏運動、患有基礎性疾病等內外因素都能誘發NAFLD〔7〕。NAFLD主要是以糖脂代謝異常為發病核心，整個糖脂代謝的進程中，有主要作用的是在脂肪酸代謝中過氧化酶體的β氧化〔8〕。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)ɑ屬于PPAR家族蛋白的一員，其對NAFLD發生及發展都有一定調控作用，其主要是介導轉錄水平調控脂肪酸氧化體系各種酶。研究表明，NAFLD模型大鼠的酰基輔酶A氧化酶(ACOX)1和PPARɑ表達較低，而采用GPS進行治療后可以明顯提高ACOX1和PPAR表達〔9〕。武俊紫等〔10〕用高營養飼料建立大鼠模型，通過使用的不同濃度GPS干預NAFLD進程，發現高劑量組治療NAFLD效果最顯著，同時發現經過GPS治療后， 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平都有一定降低。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)信號通路與糖尿病的關系密切，但是近些年來大家廣泛關注AMPK與NAFLD的相關性。研究表明測定AMPKα和p-AMPKα蛋白表達水平發現，p-AMPKα的蛋白水平經過GPS治療具有顯著性差異，然而AMPKα的蛋白表達在各實驗組并沒有明顯差異〔10〕，推測AMPK并不是直接發揮作用，而是通過磷酸化轉化為p-AMPKα促進能量代謝。證實GPS是通過升高p-AMPKα水平，提高能量代謝，減輕炎癥反應來改善NAFLD。AMPK的激活同時可促進下游分子核轉錄因子E2相關因子(Nrf)2的細胞核轉位，上調Nrf2表達〔11〕。Nrf2是通過調節因子抗氧化、抗炎、減輕炎癥反應，進而介導下游血紅素加氧酶(HO)-1減輕肝臟氧化應激〔12〕。與NAFLD大鼠模型組比較，GPS各劑量組可顯著增強 p-AMPK、Nrf2蛋白表達水平，表明GPS是由于激活AMPK/Nrf2信號途徑，進而緩解氧化應激之后達到保護肝臟的作用〔13〕。NAFLD也是一類和胰島素抵抗緊密有關的代謝應激性疾病，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是和胰島素作用關系緊密的通路之一。實驗發現，Nrf2/HO-1通路是保護肝臟抑制氧化應激損傷的主要傳導通路之一〔14〕。研究報道采用GPS治療可有效緩解泰洛沙泊引起的大鼠NAFLD，表明GPS通過激活Nrf2/HO-1、PI3K/Akt信號通路，進而發揮抗炎、抗氧化、減緩胰島素抵抗作用，并提高p-AMPK的水平，導致脂質累積減少〔15〕。Jin等〔16〕研究發現GPS可以通過提高細胞活力、減少脂肪沉積、下調三酰甘油(TG)和激活游離脂肪酸(FFA)誘導的HepG2細胞核Nrf2來有效緩解NAFLD。

2 GPS和AFLD

AFLD是指由于酒精攝入不合理(指每日喝酒量折合酒精40 g以上或每周140 g以上者) 而致使的一系列肝臟損害病變，從而進展為肝炎、HF，最終會導致肝硬化及一系列特重并發癥〔17〕。AFLD患者首先應該進行戒酒，但戒酒對于晚期AFLD已無法逆轉，對于末期AFLD患者只能進行肝移植進行治療。近些年來，在醫學方面并沒有成熟的治療AFLD方法，也沒有好的方法能夠顯著提高AFLD患者生存率。 所以，成熟的AFLD的治療藥物應該是可篩選的、有效果的、無副作用的。在整個AFLD的病理過程中，PPARɑ和膽固醇調節元件結合蛋白(SREBP)1發揮著重要作用，它們通過調節脂質的累積和脂肪酸的氧化影響AFLD發生、發展。酒精的攝取會直接或間接影響和脂質代謝有關的轉錄因子，然后抑制脂肪酸氧化和促進脂肪酸合成〔18〕。Li等〔19〕研究發現用酒精誘導的小鼠慢性和急性AFLD損傷模型中，GPS可減少丙氨酪氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和積累的TG含量。也發現GPS可提高肝激酶(LKB)1和AMPK表達水平，進而來調節SREBP1表達水平。另外，研究證實GPS可調節PPARɑ和磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)表達水平。GPS可使P2X嘌呤受體7(P2X7受體)-NOD樣受體蛋白(NLRP)3炎性小體的活化受到阻礙并抑制了白細胞介素(IL)-1β的產生。張玉〔20〕研究發現，在乙醇暴露的HepG2細胞中，GPS通過激活 P2X7受體-NLRP3炎性體減少脂肪生成并促進脂質氧化。P2X7受體的遺傳或藥理學阻斷增強了AMPK活性并降低了乙醇處理的HepG2細胞中SREBP1表達。GPS可下調由于脂多糖/三磷酸腺苷刺激的RAW264.7巨噬細胞和骨髓衍生巨噬細胞中P2X7受體介導的炎癥反應。來自巨噬細胞的IL-1β加速了肝細胞脂質積累。氯膦酸鹽脂質體消耗巨噬細胞改善了酒精性肝脂肪變性，GPS進一步緩解了這種情況。Zhang等〔21〕研究發現，GPS通過調節血脂水平，增加抗氧化能力，對AFLD大鼠表現出良好的保肝活性。其潛在機制與通過恢復線粒體膜電位水平、ATP濃度、三羧酸循環關鍵酶活性和復合物Ⅳ活性、調節小分子代謝和抗細胞凋亡來調節線粒體功能障礙有關。Yang等〔22〕研究發現，GPS預處理改善了慢性乙醇喂養C57BL/6小鼠引起的脂質代謝失衡，以調節脂質積累為特征。在乙醇處理的AML12細胞中也證實了GPS抑制脂質合成和促進氧化。GPS可以防止肝臟脂肪變性發展為慢性酒精暴露引起的輕度纖維化，這表明GPS可能是一種有前途的治療AFLD早期的療法。

3 GPS和HF

HF是肝臟受到體內外各種致病因子侵襲后，過度修復進而引起肝臟各種細胞發生病理性改變，最終致使纖維化形成〔23,24〕。HF是可逆的，如果及時進行治療，就可以逆轉病情。近些年來使用中藥治療HF引起廣泛重視。音猬因子(Shh)信號途徑是作用于HF過程中的主要通路之一，阻止Shh信號途徑可能是醫治HF的有效靶點〔25〕。李梓萌等〔26〕研究結果表明，采用GPS給藥后，大鼠肝組織Shh、Gli家族鋅指蛋白(Gli)1、轉化生長因子(TGF)-β1和α-平滑肌肌動蛋白(SMA)的蛋白表達水平顯著降低，表明采用GPS治療有抗HF的作用，可能是抑制Shh信號通路發揮作用。細胞外基質(ECM)的主要成分包括透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)等，HF發展過程中的時候，ECM異常沉積導致HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C升高〔27〕。研究證實使用GPS后大鼠血清中HA、LN、PC Ⅲ及Ⅳ-C含量顯著降低〔26〕，可推測GPS對大鼠HF具有保護作用。HF的發展階段大致可分為肝損傷、肝星狀細胞(HSCs)的活化同時分泌細胞因子和膠原，ECM代謝異常三個階段〔28〕。CCl4是建立HF小鼠模型的經典誘導劑，CCl4致HF大鼠模型的病理學變化與人類HF的病理學改變較接近〔29〕。研究證實GPS干預能有效緩解CCl4導致的血清ALT、AST活性升高〔30〕。薩可佳〔31〕研究發現GPS給藥組肝臟結構清晰完整，未發現明顯的損傷，尤其GPS高濃度組改善尤為顯著，表明使用GPS對由于CCl4導致的肝臟受損有干預作用。也有實驗證實GPS可使Toll樣受體(TLR)4/MyD88/核因子(NF)-κB信號通路受到抑制，從而導致下游炎癥效應因子的降低，因而起到保肝作用〔32〕。還有研究發現GPS可抑制由氨基半乳糖(d-GalN)/脂多糖(LPS)引起的肝損傷，其機制主要由于其抗凋亡活性〔33〕。HF的過程中會伴隨著不同程度的氧化應激，有效抑制氧化應激是抗HF的重要手段。大鼠肝臟受到CCl4的刺激時，在健康情況下，機體存在的抗氧化防御機制可以維持機體內自由基的生成與降解處在動態平衡，并產生總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)來保護機體免受自由基和活性氧氧化應激刺激，T-SOD和GSH-Px可通過加強機體抗氧化功能維持機體平衡。研究發現GPS給藥后能顯著降低大鼠丙二醛(MDA)含量，升高T-SOD和GSH-Px活性，推測GPS可以有效降低CCl4致小鼠的氧化應激水平〔34〕。

4 GPS和肝癌

肝癌是全世界難治愈的惡性腫瘤之一，連續多年來，我國肝癌病人的負擔持續加重，患病率、發病率和死亡率均呈上升趨勢。肝癌前期不容易覺察，大多數病人被診斷時已處于肝癌末期，錯過了最好的治療時間。由于從傳統中藥中提取的天然產物具有副作用低、療效確切、多靶點、多途徑等優勢，在肝癌治療領域逐漸引起了人們的關注。黃馨慧等〔35〕的實驗證實SMMC-7721肝癌細胞經104nmol/L和102nmol/L的GPS作用48 h后，細胞活力降低，其細胞活力值與對照相比差異顯著(P<0.01)。趙忠偉等〔36〕研究發現人肝癌細胞HepG2經GPS作用后，增殖明顯減慢，且與GPS的劑量呈依賴性;也發現GPS對人肝癌細胞HepG2周期有明顯影響，無論是DNA合成期還是G2/M期細胞都有不同程度減少，同時也使細胞停滯在G0/G1期。張志恒等〔37〕給小鼠皮下注射H22細胞懸液建立小鼠肝癌模型，研究發現使用GPS治療后，小鼠體重無明顯變化，而瘤重變化有顯著差異，胸腺指數和脾指數也有不同程度的升高，而瘤組織堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、p-PI3K及p-Akt表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)。說明GPS對H22肝癌小鼠腫瘤生長有抑制作用，該作用與提高免疫力，增加血清干擾素(IFN)-γ、IL-2含量及抑制PI3K/Akt信號通路的活化有關。Huang等〔38〕研究結果顯示GPS可誘導HL1C肝癌細胞Akt磷酸化并抑制HL1C肝癌細胞胞質形式的磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PCK)1 mRNA表達，還可誘導細胞外信號調節酶(ERK)1/2磷酸化。綜上，GPS可通過升高p-AMPKα蛋白、激活AMPK/Nrf2、Nrf2/HO-1、PI3K/Akt信號通路調控NAFLD；通過升高LKB1、AMPK蛋白水平，調節SREBP1、AMPK、PPARɑ、ACC表達水平等作用延緩AFLD病程；通過降低HA、LN、PC Ⅲ及Ⅳ-C的含量等作用減輕HF程度；GPS可使SMMC-7721肝癌細胞活力降低，可抑制H22肝癌小鼠腫瘤生長。由于肝臟疾病的復雜，在臨床上并沒有特別有效的治療方法，本文闡述了GPS在NAFLD、AFLD、HF、肝癌的藥理作用，但對于GPS在肝臟生理及病理中的作用還沒有完全闡明，需進一步研究。