六味能消制劑中土木香內酯和異土木香內酯含量測定研究及工藝探討

焦興蘋 馬青青 楊鳳梅

青海省藥品檢驗檢測院/國家藥品監督管理局中藥(藏藥)，青海 西寧 810016;質量控制重點實驗室/青海省中藏藥現代化研究重點實驗室，青海 西寧 810016

六味能消制劑(六味能消丸、六味能消膠囊及六味能消片，以下同)是由藏木香、干姜、訶子、大黃、寒水石、堿花等六味藥材制成的復方制劑[1]。主要功效為：助消化，消腫，理風和胃，用于食物中毒癥、積食不化、胃疼痛、胸腹腫脹、大便干燥、難產、胞衣脫落難等癥[2]。

藏木香味甘、苦、辛，藏醫理論認為其可助消化，清風熱、隆血熱、培根熱，治療疫癘、胃脘疾病與培根赤巴癥等[3]；中醫認為其具有健脾和胃，行氣止痛的功效，用于治療胸肋、腕腹脹痛，嘔吐瀉痢，胸肋挫痛等癥[4]。藏木香中土木香內酯和異土木香內酯具有多種藥理活性[5-6]，如土木香內酯與異土木香內酯均有殺蟲作用，分離純化的異土木香內酯對四氯化碳致大鼠的肝損傷具有保護作用[7]。

藏木香在六味能消制劑的功能與主治中起關鍵作用，本研究采用氣相色譜法對A、B、C、D 4個廠家生產的六味能消制劑中藏木香所含揮發性成分土木香內酯和異土木香內酯的總含量進行了測定，并制定合理限度，從而考察該制劑中藏木香是否規范投料以及各廠家生產工藝中溫度參數是否合理。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Sartorius SQP電子天平(德國賽多利斯)；7890B型氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Milli-Q advantage A10超純水系統(Merck millipore)。

1.2 試藥 藏木香對照藥材(中國食品藥品鑒定研究院，批號：121630-201001)、土木香內酯對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號：110760-201811；純度：99.4%)、異土木香內酯對照品(中國食品藥品鑒定研究院，批號：110761-201510；純度：98.8%)中國食品藥品鑒定研究院；甲醇(AR，西隴化工股份有限公司)。

1.3樣品 六味能消丸(膠囊、片)共29批，涉及青海省、甘肅省、西藏自治區的4個生產廠家4種規格，該樣品均為市售樣品。詳細信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 土木香內酯和異土木香內酯總含量測定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 混合對照品溶液 精密稱取土木香內酯對照品10.83 mg、異土木香內酯對照品10.47 mg分別置25 mL具塞容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得土木香內酯(濃度：0.43060 mg·mL-1)、異土木香內酯(濃度：0.41377 mg·mL-1)對照品儲備液。分別精密吸取各儲備液1.5 mL置于50 mL具塞容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得(該混合對照品溶液含土木香內酯12.9180μg·mL-1，異土木香內酯為12.4131μg·mL-1)。

2.1.1.2 樣品溶液 取六味能消丸(膠囊、片)粉末1.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(220 V 35 kHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.1.3 陰性樣品溶液 參照六味能消膠囊處方，按比例稱取除藏木香外其余各藥材，制成缺藏木香陰性樣品，并依照“2.1.1.3”方法制備，即得缺藏木香陰性對照溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5毛細管柱(柱長30 m,內徑0.32 mm)；進樣口溫度：260 ℃；分流比：5∶1；檢測器(FID)溫度：280 ℃；流量控制模式：恒流模式；氮氣(載氣)：40 mL·min-1；氫氣：40 mL·min-1；空氣：400 mL·min-1；流量：1.5 m·min-1；柱溫：程序升溫，初始溫度為165 ℃，保持25 min，以90 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持5 min。

2.1.3 系統適用性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、樣品溶液與陰性樣品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定。結果顯示，樣品溶液色譜中在與土木香內酯、異土木香內酯混合對照品色譜峰相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，陰性樣品溶液無干擾，各成分色譜圖如圖1所示。

1.土木香內酯；2.異土木香內酯圖1 混合對照品溶液(A)、樣品溶液(B)、陰性樣品溶液(C)GC圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 分別精密吸取土木香內酯(0.43060 mg ·mL-1)、異土木香內酯(0.41377 mg ·mL-1)的對照品儲備液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、3 mL，分別混至5個50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混標溶液。分別精密吸取各系列濃度的標準溶液1μL，注入氣相色譜儀，測定，以混合對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線。得土木香內酯、異土木香內酯的回歸方程分別為y=2.8704x+0.6924，相關系數r=0.9981，y=2.996x+0.4569，相關系數r=0.9991；土木香內酯、異土木香內酯進樣量分別在4.31～25.83 μg·mL-1、4.14～24.83 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取土木香內酯(12.9180 μg·mL-1)、異土木香內酯(12.4134 μg·mL-1)的混合對照品溶液1 μL，連續進樣5次，測得土木香內酯、異土木香內酯峰面積RSD分別為0.79%、0.62%，結果表明土木香內酯、異土木香內酯精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗 精密稱取六味能消膠囊(企業C批號190701)粉末1.0 g，按“2.1.1.2”項下方法制備，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入氣相色譜，記錄峰面積，結果土木香內酯、異土木香內酯峰面積RSD分別為0.91%、1.00%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.4 重復性試驗 精密稱取六味能消膠囊(企業C批號190701)粉末1.0 g，共6份，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定并計算含量，結果土木香內酯、異土木香內酯的總含量RSD為0.88%，表明方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知含量的六味能消膠囊(企業C 批號190701)粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入土木香內酯(3.8754 μg ·mL-1)、異土木香內酯(5.3790 μg·mL-1)的混合對照品溶液25 mL，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。測得土木香內酯、異土木香內酯平均回收率分別為101.72%、102.85%，RSD分別為0.98%、1.51%。

2.3 樣品測定 將4家企業29批不同批次的樣品，照“2.1.1.2”方法制備成供試品溶液。按“2.1.2”項下色譜條件進行測定，根據藏木香在各劑型處方中的占比計算土木香內酯、異土木香內酯的總含量。結果見表2。其中丸劑共有15批，測定結果最大值為0.87 mg/g，最小值為0.06 mg/g，平均值為0.24 mg/g，中位值為0.11 mg/g；膠囊劑共有10批，測定結果最大值為1.07 mg/粒，最小值為0.17 mg/粒，平均值為0.38 mg/粒，中位值為0.25 mg/粒；片劑共有4批，測定結果最大值為1.08 mg/粒，最小值為0.69 mg/粒，平均值為0.94 mg/粒，中位值為1.00 mg/粒。

表2 土木香內酯、異土木香內酯總含量測定結果 (n=2)

3 結果分析及討論

3.1 結果分析 測定結果表明，六味能消制劑不同生產企業間、相同生產企業不同批次間土木香內酯、異土木香內酯總含量均存在一定差異(利用SPSS軟件繪圖，如圖2所示)。藏木香屬于揮發性藥材，其中含有萜類揮發性成分較多，這些成分對溫度較為敏感，含量受原料質量、儲藏、生產工藝的影響較大，企業C、企業D生產工藝各流程溫度均控制在較低水平，并且加熱時間短，土木香內酯和異土木香內酯含量結果均在較高水平；企業A、企業B生產工藝中投料原藥材滅菌溫度高于100 ℃，并且加熱時較長，導致土木香內酯和異土木香內酯的轉移率進一步下降，造成含量結果均處于較低水平。

圖2 六味能消制劑各生產企業土木香內酯、異土木香內酯總含量箱式圖

3.2 色譜條件考察 筆者參考《中國藥典》2020年版一部中土木香項下含量測定方法及相關文獻，考察了甲醇、乙酸乙酯等溶劑的提取效果，結果顯示甲醇提取率較其他溶劑高，因此采用甲醇作為提取溶劑[8]。分別采用DB-5，DB-17，HP-5色譜柱考察分離效果，結果HP-5毛細管柱分離效果好，溶劑峰影響較小，故本實驗采用HP-5色譜柱。

3.3 討論 目前六味能消制劑標準不統一，僅有六味能消膠囊具藏木香的定性考察。定量控制手段的缺乏，使得各標準無法客觀反映藏木香藥材的整體質量，造成部分企業或為追求利潤以次充好、或工藝條件設置不合理等情況，導致了六味能消制劑中土木香內酯、異土木香內酯含量較低，影響了六味能消制劑的質量和療效。本文建立了GC法測定土木香內酯、異土木香內酯含量，該測定方法操作簡單，結果準確，可以用于考察六味能消制劑的質量，為完善六味能消制劑標準和設置工藝參數提供依據。同時建議企業生產企業加強揮發性藥材的原料管理和控制，優化生產工藝，完善和提高民族藥質量標準研究，促進民族藥的快速發展。