小飛揚(yáng)草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

莫單丹 唐炳蘭 龔小妹 歐春麗 周小雷 陸永梅 谷筱玉

1.廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心，廣西 南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局，廣西 南寧 530012

小飛揚(yáng)草，大戟科植物千根草EuphorbiathymifoliaL.的干燥全草。別名有小飛羊草、飛揚(yáng)草、痢子草、乳汁草、紅地茜 、小飛揚(yáng)、地錦草[1-3]。多生于山地沖積土或砂質(zhì)土上，亦生于低海拔的山坡草地、路旁或稀疏灌木叢中。主要分布于江西、福建、臺(tái)灣、湖南、廣東、海南、廣西、貴州、云南等省區(qū)。在廣西主要分布在鐘山、岑溪、平南、桂平、玉林、陸川、凌云、南寧、桂林、梧州、欽州、天峨各地[4]。具有清熱祛濕、收斂止癢的功效，主治痢疾、泄瀉、瘧疾、癰瘡、濕疹等[5-6]。該藥是廣西瑤族常用傳統(tǒng)藥材，瑤藥名為飛揚(yáng)端(feih iangh dorn)，傳統(tǒng)用于治療小兒疳積、痢疾、腸炎、腹瀉、皮炎、濕疹、乳腺炎[7]，國(guó)家和地方標(biāo)準(zhǔn)均未收載，為《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第二卷)》擬收載品種。因此，本研究通過(guò)對(duì)小飛揚(yáng)草性狀、顯微及薄層色譜(TLC)鑒別，以及水分、總灰分、浸出物含量測(cè)定等項(xiàng)目進(jìn)行研究，為該藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica RM2255)；LEICA生物顯微(DM2000 LEICA/Germany)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(邦西儀器科技有限公司，型號(hào)：HH-6)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA2004)；電子分析天平(CP2250D，Sartorius)；超純水儀(美國(guó)Millipore Milli-Q Academic)。

1.2 試藥 硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)，甲醇、石油醚(60～90 ℃)、三氯甲烷等實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。小飛揚(yáng)草10個(gè)樣品分別采于廣西桂林市恭城瑤族自治縣、灌陽(yáng)縣等地，經(jīng)韋松基教授和黃云峰副研究員鑒定為大戟科植物千根草EuphorbiathymifoliaL.的全草(如圖1所示)，10批樣品的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。樣品 XFYC-1、XFYC-2同時(shí)制成臘葉標(biāo)本(如圖2所示)，實(shí)驗(yàn)中以XFYC-3樣品作為小飛揚(yáng)草的對(duì)照藥材與其他樣品進(jìn)行對(duì)比。將所有10 份樣品干燥、粉碎處理，過(guò)40目篩，備用。

表1 小飛揚(yáng)草樣品信息一覽表

圖1 小飛揚(yáng)草原植物圖

圖2 小飛揚(yáng)草標(biāo)本圖

2 方法[8-10]與結(jié)果

2.1 藥材性狀與顯微特征

2.1.1 方法 藥材性狀通過(guò)對(duì)藥材的形狀、大小、顏色、斷面、氣、味等進(jìn)行觀察并描述分析。顯微特征分別取藥材莖按石蠟切片法制作切片，取藥材粉末按粉末制片法制作粉末片，在顯微鏡下觀察拍照并描述。

2.1.2 藥材性狀 本品呈卷曲的團(tuán)狀，灰綠色至灰褐色。根纖細(xì)。莖細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)10～20 cm，直徑約1 mm，基部較粗，紅棕色，稍被毛，質(zhì)稍韌，中空。葉灰綠色或稍帶黃色，對(duì)生，多皺縮，展開(kāi)后為橢圓形、長(zhǎng)圓形或倒卵形，長(zhǎng)4～8 mm，2～5 mm，邊緣有細(xì)鋸齒，葉柄極短。花序生于葉腋，蒴果卵狀三棱形，直徑約1.5 mm，被貼伏的短柔毛。氣微，味微酸、澀。如圖3所示。

圖3 小飛揚(yáng)草藥材圖

2.1.3 莖橫切 表皮細(xì)胞 1列，多呈長(zhǎng)圓形，外壁增厚。皮層細(xì)胞含較多淀粉粒和散在乳汁管。中柱鞘纖維斷續(xù)懷狀排列。韌皮部狹窄。木質(zhì)部導(dǎo)管多靠近內(nèi)側(cè)；髓部寬廣，在近木質(zhì)部處有較多草酸鈣結(jié)晶。如圖 4、圖 5所示。

2.1.4 粉末特征 本品粉末淺黃色。草酸鈣方晶呈類(lèi)方形或不規(guī)則團(tuán)塊狀，直徑約20～40 μm； 木纖維成束或散在，直徑約3～12 μm；紅棕色花粉管多見(jiàn)，內(nèi)含黃棕色花粉粒，花粉粒或單個(gè)散在，部分可見(jiàn)三個(gè)萌發(fā)孔，類(lèi)球形，直徑約8～13 μm；非腺毛由1～9 個(gè)細(xì)胞組成，多彎曲，壁薄，直徑約5～10 μm；螺紋導(dǎo)管多見(jiàn)，直徑約5～15 μm；表皮細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或四邊形，表面分散有多橢圓形氣孔，直徑約5～17 μm，氣孔不等式；木栓細(xì)胞呈類(lèi)橢圓形，棕黃色，直徑約3～6 μm。如圖6所示。

1.表皮；2.皮層;3.淀粉粒;4.中柱鞘纖維;5.韌皮部;6.木質(zhì)部;7.髓部;8.草酸鈣結(jié)晶;9.乳汁管圖4 小飛揚(yáng)草莖橫切面顯微圖

1.淀粉粒;2.草酸鈣結(jié)晶圖5 小飛揚(yáng)草莖橫切面顯微放大圖

1.纖維束;2.草酸鈣方晶;3.花粉粒;4.導(dǎo)管;5.木栓細(xì)胞;6.非腺毛圖6 小飛揚(yáng)草粉末顯微圖

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 方法 進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，考察薄層色譜分離的效果，確定供試品取樣量、提取方法、點(diǎn)樣量等條件；選擇合適的對(duì)照物質(zhì)，確定對(duì)照物質(zhì)用量、溶劑、濃度、點(diǎn)樣量并經(jīng)方法驗(yàn)證，還進(jìn)行耐用性試驗(yàn)(不同溫、濕度的試驗(yàn)等)。根據(jù)分離良好，圖譜清晰，斑點(diǎn)明顯，重現(xiàn)性好的要求，選擇合適的固定相、展開(kāi)劑及顯色方法等色譜條件。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，加 95%乙醇溶液50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，依次用石油醚和三氯甲烷萃取，各提取2次，每次10 mL，棄去石油醚提取液，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取小飛揚(yáng)草對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 薄層色譜條件及結(jié)果 薄層色譜鑒別[11]參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502薄層色譜法，吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(8∶5∶2∶0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出， 晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。如圖 7所示。

1,6,10:對(duì)照藥材;2～5,7～9,11～12:樣品;A:藍(lán)色熒光主斑點(diǎn)圖7 小飛揚(yáng)草樣品 TLC 圖

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物的測(cè)定

2.3.1 測(cè)定方法[11]水分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0832水分測(cè)定法測(cè)定；總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2302灰分測(cè)定法測(cè)定；浸出物測(cè)定參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2201項(xiàng)下的冷浸法進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2 測(cè)定結(jié)果 10批樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，10批樣品水分含量在7.96%～13.25%之間，總灰分含量在10.16%～16.18%之間，酸不溶性灰分含量在2.95%～8.18%之間，70%乙醇浸出物(冷浸法)含量在14.18%～24.18%之間。

表2 小飛揚(yáng)草樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測(cè)定結(jié)果一覽表 (n=3,%)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 現(xiàn)代研究[12-14]表明小飛揚(yáng)草主要含有黃酮、單寧、甾體、萜類(lèi)和酚酸性成分，并發(fā)現(xiàn)小飛揚(yáng)草具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗高血糖、細(xì)胞毒性、保腎和保肝、利尿通便等多種生物活性[15-19]。關(guān)于小飛揚(yáng)草作為瑤藥使用時(shí)的主要有效成分及作用機(jī)制的研究目前尚處于空白，有待進(jìn)一步研究。抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用與其作為瑤藥使用功效相符，有報(bào)道其分離物中木犀草素可能是其發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。本研究嘗試以木犀草素為對(duì)照品，對(duì)小飛揚(yáng)草進(jìn)行薄層色譜鑒別和質(zhì)量控制，但小飛揚(yáng)草對(duì)照藥材及樣品中薄層色譜中均未顯示出與木犀草素對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，表明該提取物中不含有木犀草素或含量較低，不能用作薄層鑒別的指標(biāo)成分。文獻(xiàn)還報(bào)道小飛揚(yáng)草中含有槲皮素、山奈酚、沒(méi)食子酸等成分[13]，但考慮這些成分為植物中普遍存在的化合物，應(yīng)避免選用專(zhuān)屬性不強(qiáng)的化合物作為指標(biāo)性成分。因此，在未能找到適宜的薄層鑒別指標(biāo)成分的情況下，采用經(jīng)專(zhuān)家鑒定的小飛揚(yáng)草作為對(duì)照藥材用于小飛揚(yáng)草的薄層鑒別。

3.2 薄層色譜方法的驗(yàn)證 預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，用各產(chǎn)地的小飛揚(yáng)草樣品試液進(jìn)行了展開(kāi)劑的探索，嘗試了三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇(1∶8∶3)、石油醚-醋酸乙酯(90∶1)、三氯甲烷-醋酸乙酯(15∶1)、石油醚-三氯甲烷-甲醇(20∶1∶1)、石油醚-三氯甲烷-甲醇(15∶1∶1)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇(3∶1∶0.5)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(3∶2∶1.5)、石油醚-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇(5∶5∶1.5∶0.5)等展開(kāi)系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定以石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(8∶5∶ 2∶ 0.8)為展開(kāi)劑，得到的薄層色譜斑點(diǎn)分離度較好。同時(shí)比較了不同廠家、不同類(lèi)型預(yù)制板，不同展開(kāi)溫度和濕度進(jìn)行考察，結(jié)果均表明本法的耐用性良好。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，考慮到小飛揚(yáng)草藥材為南方所產(chǎn)，而南方氣候較為濕潤(rùn)，因此將水分?jǐn)M訂為不得過(guò)14.0%，總灰分?jǐn)M定為不得過(guò)17.0%，酸不溶性灰分?jǐn)M定為不得過(guò)9.0%；浸出溶劑的選擇方面，采用不同濃度的乙醇和水作為溶劑來(lái)提取，結(jié)果顯示浸出溶劑乙醇濃度小于70%時(shí)，浸出物含量隨乙醇濃度的增大而呈上升趨勢(shì)，但浸出溶劑乙醇濃度大于70%時(shí)，浸出物含量反而隨乙醇濃度的增大呈下降趨勢(shì)，為了降低藥材無(wú)效成分的溶出度，重點(diǎn)兼顧富集小飛揚(yáng)草黃酮類(lèi)脂溶性和水溶性等主要活性成分，因此擬定浸出物測(cè)定采用70%乙醇作為溶劑的冷浸法，含量不得少于14.0%。本文對(duì)小飛揚(yáng)草開(kāi)展了藥材性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物等方面的研究,初步制定了小飛揚(yáng)草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為小飛揚(yáng)草的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，并可為進(jìn)一步完善和提升小飛揚(yáng)草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。