甲氨蝶呤細胞內代謝過程的研究

陳馨媛

(中山大學附屬第七醫院 廣東 深圳 518107)

1 實驗材料

1.1儀器

二氧化碳培養箱(Thermo Fisher Scientific，美國)；MINI4-UVF超純水儀(湖南科爾頓)；電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特)；TGL 20M臺式冷凍高速離心機(長沙英泰)；倒置式生物顯微鏡(重慶奧特光學)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(Tecan，瑞士)；二氧化碳培養箱(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.2藥品與試劑

人肺癌細胞A549、人肝癌細胞 BEL-7402、人高轉移性肝癌細胞 MHCC97H 細胞。RPMI-1640 培養基(Gibco，美國)；DMEM 高糖培基(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS，BI，以色列)；0.25% EDTA 胰蛋白酶(Gibco，美國)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone，美國)；雙抗(Solarbio，北京)；細胞凍存液(Solarbio，北京)。

2 研究方法

2.1 細胞毒性試驗

胰酶消化對數生長細胞，計數并調整細胞濃度為1×105/ml，100μl/孔吸取細胞懸液至96孔板中，培養箱中培養12h，吸棄培養基并用PBS清洗，加入培養基或含有不同濃度MTX的培養基(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μM)，培養箱中繼續培養24h。每孔中加入10μlCCK8溶液，繼續培養4h，終止培養。酶標儀在450nm處檢測吸光度值(OD)。分析MTX對細胞增殖的影響。

2.2 細胞內多聚谷氨酸化MTX (MTX-PGs)濃度測定

2.2.1細胞樣本提取

按2.1處理細胞并鋪與6孔板中，細胞濃度為2×105/ml，2ml/孔，用MTX同上處理。吸棄培養基(溶液1)，存于-80℃冰箱備用；PBS清洗每孔2-3次，加入適量胰酶消化，得到不同MTX處理下的實驗細胞的懸液，計數，以800 r/min離心5min，棄去上清液，加入PBS使得剩余的細胞沉淀重懸，將重懸后的細胞懸液置于冰浴條件下，利用超聲進行細胞破碎操作約2 min，然后將破碎好的液體進行13000 r/min離心15 min，分離出上清液置于-80℃冰箱中保存待測(溶液B)。

2.2.2細胞內MTX-PGs濃度的測定

分別取出待測溶液A、B適量，處理后利用LC-MS/MS進行進樣分析，測定不同藥物處理下細胞內MTX-PGs濃度。

色譜條件：Waters UPLC I-Class液相色譜儀；色譜柱：Waters UPLC I-Class；在線過濾器：Waters CRITICAL CLEANTM；進樣量：5 μL；自動進樣器溫度：10℃；柱溫：60℃；流速：0.3 mL/min；流動相：10 mM碳酸氫銨水溶液(0.3%氨水)(A)，乙腈(B)；洗脫程序：0 min 95% A， 0～1 min 95% A，1～1.2min 80% A，1.2～1.5 min 80% A，1.5～2.5 min 60% A，2.5～3 min 95% A；運行時間：3 min。檢測波長：260 nm。

質譜條件：Waters Xevo TQ-S；離子源：電噴霧離子源(Electrospray ionization source，ESI)；離子源溫度(℃)：150；毛細管電壓(KV)：1；脫溶劑氣流(L/h)：1000；脫溶劑溫度(℃)：500；電離模式：正離子；信號采集模式：多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)；峰寬：4 s；單個峰采集點數：12。

2.3 統計分析

利用SPSS 19.0統計軟件中Pearson相關系數進行相關性檢驗，判別標準為，無相關性0

3 實驗結果

3.1 MTX對三種細胞的毒性分析

參照已有文獻[3]，以24h作為細胞毒性實驗終點，分析了MTX對三種細胞的毒性，得到結果如下：

表1 細胞毒性分析結果

3.2濃度梯度MTX中實驗細胞的抑制率曲線

圖1 不同濃度MTX處理24 h對三種細胞的抑制率曲線

由表1和圖1可知，MTX對三種細胞株的抑制率近似，且存在著隨著濃度的增加，抑制率先增加后趨于平緩的趨勢。A549對MTX的耐受度略高于BEL-7402和MHCC97H。

3.3濃度梯度MTX中處理下細胞MTX-PGs的蓄積曲線

圖2 梯度MTX處理三種細胞24 h后胞內MTX-PGs定量結果

為了進一步探究不同濃度MTX對細胞抑制率曲線逐漸放緩的深層次原因，我們根據上述結果，縮小了濃度區間，選擇了抑制率曲線的拐角處濃度(0.1、0.3、0.8、1.5、5.0 μM)，測定三種細胞內MTX及其代謝物的濃度。從原型藥物及其代謝物濃度梯度曲線中我們可以看出，細胞內MTX原型藥物的濃度隨著藥物處理濃度的增加而不斷上升，而MTX-PG2-7濃度曲線變化卻逐漸放緩，這提示我們，MTX在細胞內的代謝生成MTX-PG2-7的過程中，存在著限速步驟。

4 討論

4.1 MTX在細胞內代謝過程中的限速步驟分析

根據MTX在細胞內的代謝的藥理過程，我們推測出，之所以出現這種反常的臨床現象，因為MTX的主要發揮作用的活性成分(MTX-PG2-7)的生成速率受到了FPGS飽和的影響。在同樣的給藥劑量下，慢速輸注中的血藥濃度低于快速輸注，FPGS已經飽和，因此兩種輸注方式下的細胞中MTX-PG2-7的生成速率差別并不大；慢速輸注時，由于MTX在血漿中的暴露時間長于快速輸注的暴露時間，即MTX-PG2-7在細胞中的蓄積作用明顯大于快速輸注的累積，因此出現了上述臨床現象。

為了能夠從細胞層面驗證上述猜測，我們用梯度濃度MTX處理細胞，從結果中可以看出，隨著MTX處理濃度的升高， MTX對細胞的抑制率出現了先明顯升高，后增速放緩的趨勢。這說明，在增大甲氨蝶呤的處理濃度時，抑制率并不會隨著濃度的增加出現正比例上升。我們針對三種細胞抑制率與其處理濃度的關系，做Pearson相關性分析，得到在細胞株A549、BEL-7402、MHCC97H中，藥物處理濃度與細胞抑制率的Pearson相關系數r分別為0.46、0.64、0.613，相關性一般，因此認為藥物處理濃度與實驗細胞的抑制率雖然有一定的相關性，但可能不是影響細胞抑制率的唯一因素?？紤]到MTX真正發揮藥效的成分為靶細胞中代謝后產生的MTX-PG2-7，推測MTX-PG2-7濃度的變化可能是影響細胞抑制率的主要原因。

為了進一步研究細胞內，在FPGS和GGH催化作用下代謝的MTX的代謝物的變化過程，對各濃度MTX處理后的細胞內PGs的表達情況進行分析，做出曲線如圖2。由圖2可知，隨著MTX給藥量的不斷增加，細胞內甲MTX原型藥物(MTX-PG1)隨給藥劑量增大而大幅增加，而剩余的MTX代謝產物(MTX-PG2-7)隨著給藥濃度的增加，呈現出與抑制率曲線相似的先增加后趨于平緩的趨勢，該趨勢的相似性進一步說明了MTX主要靠其在細胞內的代謝產物MTX-PG2-7發揮其藥理作用。

為探究MTX處理濃度與胞內MTX-PGs間相關性，經Pearson相關性分析得下表：

表2 三種細胞給藥濃度與MTX原型藥物及各代謝物濃度關系

從Pearson相關系數中我們可以看出，在三種細胞株內，MTX在細胞內的蓄積濃度，與外界給予的藥物處理濃度均為強相關性，這應該與MTX從外界轉運至細胞內的轉運途徑有關。在前期的文獻調研中得到[4]，外部環境的MTX可經RFC、PCFT、OATP1B1等多個蛋白進行主動轉運，或在濃度較高的時候通過被動擴散進入細胞。因此，MTX從外界轉運至細胞內的轉運過程，沒有明顯的限速步驟，細胞內的MTX-PG1蓄積濃度，受外界藥物濃度的直接影響。但是，我們發現，MTX-PG2-6的相關系數中，三種細胞株在梯度MTX處理24 h后，細胞內蓄積的MTX-PG2-6絕大部分與藥物處理濃度沒有相關性。這可能是由于甲氨蝶呤在細胞內的代謝過程較為復雜，細胞內游離的 MTX在FPGS的催化作用下逐個連上2-6個谷氨酸，形成MTX-PGs。同時，MTX-PGs 被GGH水解去谷氨酸化，成為MTX后排出細胞[5]。MTX在細胞內經過FPGS谷氨酸化后，由于分子量的增加和結構的改變，不能夠被外排蛋白很好的排泄，導致了MTX胞內代謝的活性成分在細胞內產生蓄積，從而引發了細胞毒性，只有當GGH將其水解后，才能由外排蛋白排出細胞[6]。因此，從MTX胞內代謝的藥理機制可以看出，細胞內MTX-PG2-6與外界MTX處理濃度無明顯相關性。而胞內MTX-PGs蓄積濃度曲線隨給藥濃度的上述的逐漸趨于平緩可能是由于FPGS所參與的谷氨酸化過程容易飽和，限制了高濃度處理下的細胞MTX-PGs的生成速率。而GGH的底物由FPGS代謝生成，濃度較少，猜測其不存在飽和情況。

5 總結

為了證明FPGS容易發生飽和，限制胞內MTX-PGs生成速率的猜想，我們設計了由表及里的兩個層次的細胞實驗，結合MTX胞內代謝過程的藥理學研究基礎，猜測FPGS和GGH是影響MTX-PG2-7蓄積過程的重要因素。