多發性硬化癥免疫缺陷鼠的中樞神經炎癥反應觀察

摘要：腦脊髓脫髓鞘是多發性硬化癥（MS）的主要病理特征。為了建立病毒性腦脊髓脫髓鞘免疫缺陷小鼠模型，探索其神經炎癥發生發展的潛在機制。NOD- SCID小鼠12只隨機分為感染組和對照組，每組6只，分別腦部注射小鼠腦脊髓炎病毒和PBS。每天觀察臨床病癥，第25天處死小鼠。采用HE染色觀察腦部病理變化，并采用免疫熒光染色、Western blot和實時定量PCR檢測標記物的表達。結果表明小鼠腦脊髓炎病毒在患鼠腦中明顯復制并引起了神經損傷，以后肢麻痹為主要表型的神經障礙發生率為100% （6/6），小鼠腦部主要病理變化為神經元損傷、壞死，較多小膠質細胞浸潤，海馬錐體細胞明顯減少。熒光定量PCR發現腫瘤壞死因子a （TNF-a）．白細胞介素la和B aL-a，IL-13），信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3） mRNA水平均呈現顯著上升（P=0.0101．p=0.0121和P=0.0056）。Western blot發現小鼠海馬區STAT3表達顯著升高（Plt; 0.0395）。免疫熒光染色發現小膠質細胞和星形膠質細胞在海馬區顯著活化。TMEV成功誘發了免疫缺陷鼠腦脊髓炎脫髓鞘病，TMEV感染提高了免疫缺陷鼠腦部促炎因子如TNF-a、IL-1a和IL-1β的表達及海馬體小膠質細胞和星形膠質細胞增殖活化，激發了腦部炎癥，從而引起了免疫缺陷小鼠中神經系統疾病。此外，研究發現在病毒性腦脊髓脫髓鞘免疫缺陷小鼠模型中，海馬體的STAT3信號通路與腦部炎癥密切相關，以上為多發性硬化癥及病毒誘發脫髓鞘機制研究提供有力數據支撐。

關鍵詞：小鼠腦脊髓炎病毒：多發性硬化癥：免疫缺陷：神經炎癥

多發性硬化癥（Multiple Sclerosis，MS）是中樞神經系統（CNS）最普遍的慢性炎癥性疾病，是引起成年人神經性殘疾的最常見原因之一[1]。然而它的發病機制尚不清楚[2]。目前普遍認為遺傳、免疫、病毒、環境、微生物群等與MS發生有密切關系[3]。MS主要病理特征為神經退行性變與炎性脫髓鞘，表現為炎癥反應，髓鞘脫失，軸突缺失和神經膠質細胞增生。患者通常因大腦與脊髓內散播的脫髓鞘，造成多發、多樣的神經癥狀和體征，常反復緩解復發，導致殘疾甚至死亡。

動物建模是了解疾病發病機制至關重要的一種手段。目前主要有實驗性自身免疫性／過敏性腦脊髓炎（EAE）。小鼠腦脊髓炎病毒感染引起的慢性脫髓鞘疾病（TMEV-IDD）及毒素引起的脫髓鞘[4]，但以上模型均有其各自局限性[5]。多發性硬化癥與自身免疫缺陷的模型報道有限。為更好研究多發性硬化癥，研究者采用了不同品系小鼠進行TMEV-IDD建模，探究免疫系統在同一病毒引起的兩種不同疾病發展中的作用機制[6]，豐富了人們對疾病模型的認識，又促進了對MS發病機制的了解。海馬體因其在可塑性和神經發生中具有重要作用，越來越多研究者強調了評估海馬體在神經性疾病中的重要性。多發性硬化癥的一些臨床表現如記憶障礙和抑郁癥被證實與海馬體的受累有關。有研究發現海馬病理損傷在多發性硬化癥（MS）中廣泛存在，并且與記憶障礙有關[7]。本研究為探究病毒性腦脊髓脫髓鞘在免疫缺陷小鼠神經炎癥中的發生發展，將小鼠腦脊髓炎病毒接種到有T/B淋巴細胞缺陷的NOD-SCID小鼠腦部，在適應性免疫細胞耗竭情況下觀察受影響小鼠海馬炎癥反應及其病理特性。

1 材料與方法

1.1 病毒獲得

小鼠腦脊髓炎病毒（Thei ler's muri ne encephalomyel itisvirus，TMEV） BeAn毒株（ATCC VR-995）和BHK-21細胞（ATCCCCL-10）均購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。復蘇BHK-21細胞，細胞在含1 0%胎牛血清（HyClone公司，澳大利亞）DMEM高糖培養液（G i bco公司，美國）培養4d，分瓶，待細胞長至80%～90%密度，棄去生長液，加入500pL TMEV病毒液于75cm2細胞瓶中，37℃吸附l h，棄去瓶中的病毒液加入無血清的DMEM細胞維持液，37。C培養4d，當細胞病變達“+++”時，收獲病毒液，-80℃凍存，反復凍融3次后，離心去除細胞碎片，留上清即為收獲的TMEV病毒液，qRT-PCR對病毒拷貝數進行定量。

1.2 實驗動物

12只，3～4周齡的雌性NOD/SCID小鼠購于廣東藥康生物科技有限公司（生產許可證：SCXK（粵）2020-0054），質量合格證號：44824700002024。在受控室內常規條件下飼養在廣東省實驗動物監測所二級病原微生物安全實驗室內【SYXK（粵）2021-0122]；12h光照／黑暗循環，溫度為22±2℃，相對濕度為40%～60%，可隨意獲取食物和水。所有實驗均嚴格按照動物使用和管理委員會審批（l-IACUC2020106）。

1.3 模型構建實驗

所有小鼠接種前禁食不禁水過夜。分為感染組（TMEV）和假手術對照組（MOCK）。TMEV組取濃度為2×10fcopi es/μL的小鼠腦脊髓炎病毒液，腦內注射病毒液25μL／只，MOCK假手術組小鼠僅接受相同劑量的PBS。動物接種病毒后，連續觀察25d，每天觀察動物的外觀、行為活動、飲食和精神狀態等。實驗結束，小鼠脫頸椎安樂死，剖檢，快速采集左半腦放置4%甲醛固定，待HE染色和熒光染色、取右半腦海馬及腦組織置-20℃冰箱待測病毒核酸、炎癥因子和蛋白表達等。

1.4 小鼠腦病毒核酸及炎癥基因表達檢測

樣本處理和總RNA抽提：每個小鼠右側腦取0.1g，加入500μL的PBS緩沖液，再加入氧化鋯研磨珠，低溫研磨1min，將研磨后勻漿液10，000r/mi n離心5min，取200μL上清液用核酸抽提試劑盒抽提總RNA，使用DEPC水調整濃度到10ng／|JL。

使用PrimeScriptT'RT Master Mix （Perfect Real Time）（Takara公司，大連）將總RNA進行反轉錄，得到的cDNA采用Pre-mix Ex TaqTM（Probe qPCR） （Takara公司，大連）進行熒光定量PCR擴增。

TMEV核酸檢測qRT-PCR：反應體系為2×Premix Ex Taq10μL、TMEV檢測上下游引物終濃度均為0.5μmol/L，探針終濃度0. 4μ mo l/L，cDNA模板2UL，加RNase Free ddH20至20UL。反應條件為：95。C 30s，1個循環；95℃5s，60℃34s，45個循環，60℃延伸結束后收集熒光。采用TMEV質粒標準品作為參照，對樣本中的病毒拷貝數進行定量檢測。

炎癥基因mRNA表達檢測qRT-PCR：將cDNA與SYBRR@和基因引物序列（表1）按照試劑盒說明書進行體系配制。在AB17500檢測系統上一式三份分析cDNA樣品，為使每個樣品中的基因mRNA表達標準化，通過2 咄一公式量化基因表達。

1.5 病理觀察

蘇木精一伊紅染色：通過腹腔注射戊巴比妥（50mg/kg_ bw）麻醉小鼠，并用生理鹽水經心灌注。每只動物的左側大腦固定在4%多聚甲醛中，經修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后鏡檢。在顯微鏡下瀏覽切片，在不同倍數下詳細觀察組織切片情況，觀察并記錄切片中基本病理改變情況，對典型病變部位成像并用箭頭標識。組織病變（神經元損傷／壞死、小膠質細胞浸潤）程度采用五級分法，無病變計分為0；極少量病變計分為0.5；有輕度病變或少量病變計分為1；有中度病變或中等量病變計分為2；有重度病變或多量病變計分為3；有極重度病變或大量病變計分為4。

石蠟切片免疫熒光：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（pH 9．0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。滴加BSA，室溫封閉30m；n。加一抗lba-l或GFAP （Servi cebio，1：500稀釋后使用），切片平放于濕盒內4。C孵育過夜。洗滌3次后滴加與一抗相應種屬的二抗Aliexa fluor488覆蓋組織，避光室溫孵育50min。洗滌3次后滴加DAPI染液復染細胞核，避光，室溫孵10min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光或綠光。

1.6 檢測小鼠海馬區的信號轉導和轉錄激活因子3蛋白表達

取出海馬組織，按1：10的體積比加入預冷的RIPA裂解液后充分勻漿至完全裂解，低溫離心30min，取上清定量，10% SDS-PAGE電泳分離，轉膜，封閉1h，加入STAT3 -抗（Servicebio GB11176，1：1，000）后4℃孵育過夜，洗脫3次，HRP抗小鼠1gG室溫孵育2h后，洗脫，曝光、顯影，利用Image J圖像分析軟件選取目標條帶的圖像，分析灰度值。內參選用GAPDH （Servi cebio GB15002，1：2000）。相對蛋白定量=目的蛋白的灰度值／內參的灰度值。

2 統計分析

使用統計軟件SPSS （19.0版）和GraphPad Pri sm（5.0版）進行分析。使用T-test檢驗比較目標mRNA和蛋白質水平。計量資料以x±s表示，組間均數比較采用未配對的t檢驗及單因素方差分析，以plt;0. 05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 TEMV誘導免疫缺陷鼠腦脊髓炎脫髓鞘臨床表征

為了探討小鼠腦脊髓炎病毒誘導腦脊髓脫髓鞘（TMEV-l DD）在免疫缺陷鼠中的病理特征，對免疫缺陷小鼠進行腦內注射感染小鼠腦脊髓炎病毒。前14 d，非感染組和感染組小鼠的體重沒有明顯差異。第14～25d感染組小鼠體重下降幅度大干非感染組小鼠，兩組間的差異隨著時間逐漸擴大，25d體重差異顯著（圖1a）。在本研究中，病毒核酸、脾指數及神經癥狀也被記錄作為脫髓鞘進展的指標，在第25d收集并測量所有小鼠腦組織和脾組織，TMEV處理的NOD-SCID小鼠腦內病毒核酸復制明顯（圖lb），脾指數均顯著低于對照組（圖1c）。受感染的免疫缺陷鼠在20d陸續出現偏頭、共濟失調、后腿無力、轉圈或后肢麻痹癱瘓等神經損傷癥狀（圖ld）。3.2 TEMV誘導腦脊髓炎脫髓鞘在免疫缺陷鼠中的炎癥基因表達

炎癥一直被認為是腦脊髓脫髓鞘的關鍵致病因素之一[8]。本實驗測量了在出現神經障礙的小鼠大腦中的炎癥標志物。與非感染組小鼠相比，感染TMEV的免疫缺陷鼠腫瘤壞死因子a（TNF-a）高出近50倍（圖2a）。同時，促炎細胞因子白細胞介素la（IL-1 a）和白細胞介素1 β（11-1 β）的表達也分別升高了8倍和1 3倍（圖2b，2c）。這些發現表明TMEV誘導免疫缺陷鼠神經炎癥，與報道誘導敏感小鼠SJL系小鼠報告一致[6]。Stat3信號通路在細胞中的眾多信號轉導中至關重要。在各種炎癥細胞中發現了STAT3的過度激活[9]。本研究采用了qPCR及蛋白印跡檢測STAT3的mRNA和蛋白的表達水平，與非感染組小鼠相比，感染TMEV的免疫缺陷鼠腦內STAT3水平顯著上調（圖2d，2e）。結果顯示TMEV感染免疫缺陷小鼠促進了STAT信號通路的激活和促炎細胞因子基因表達。

3.3 TMEV誘導了免疫缺陷鼠腦部炎癥病理

MS與海馬區的受累有關，已有研究證實多發性硬化癥患者的海馬出現廣泛的脫髓鞘忉。為了探究海馬區在腦脊髓炎脫髓鞘免疫缺陷合并癥小鼠中的炎癥情況，對MOCK和NOD-SCID小鼠的腦進行HE染色，MOCK正常組小鼠（圖3a）腦皮層結構緊密，神經元豐富，分布均勻，海馬錐體細胞豐富，排列緊密，形態正常。模型組小鼠（圖3b）皮層、海馬等處見神經元損傷、壞死，海馬錐體細胞明顯減少，壞死神經元胞核固深染或溶解，胞漿嗜酸性增強（黑色箭頭），伴較多小膠質細胞浸潤，并見膠質細胞結節（紅色箭頭），病灶內還見較多不規則空泡，考慮神經纖維變性（黃色箭頭）。

為了探討海馬小膠質細胞和星形膠質細胞在TEMV誘導免疫缺陷鼠腦脊髓炎脫髓鞘中的潛在免疫機制，采用免疫熒光對切片進行染色，觀察小膠質細胞和星形膠質細胞在海馬中的激活情況。腦組織病理學檢查證實，經TMEV處理后，與MOCK組小鼠相比，TMEV組小鼠有更多的小膠質細胞（圖4a）和星形膠質細胞被激活（圖4b），這表明小膠質細胞和星形膠質細胞參與了TMEV誘導的免疫缺陷鼠的神經炎癥。

4 討論

以炎癥性脫髓鞘病變為特征的多發性硬化癥（MS）是發達國家年輕人最常見的神經系統疾病，它的發病率和患病率在全球范圍內呈上升趨勢[10]。目前還不清楚是什么抗原激發免疫反應，最終導致髓磷脂的破壞。大多數已知病因的人和動物的脫髓鞘疾病都是病毒性，研究者認為病毒可能也是多發性硬化癥病因的理由之一[11]。據研究推測病毒感染確實可能啟動了疾病過程[12]。目前對病毒引起的脫髓鞘發病機制的了解大部分來源于對動物模型的研究，如小鼠腦脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒等嗜神經毒株，這些研究也因此成為傳染性腦病研究前沿。動物模型盡管有其局限性，但仍然是MS研究的最有用的工具。

很多研究在不同角度評價了現有MS動物模型的優劣，如常用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）能較好反映MS自身免疫發病機制的模型，但卻不能重現典型的慢性和／或復發一緩解疾病活動的多發性硬化癥特征，而病毒誘導模型因臨床表現與在人類慢性進行性MS中觀察到的非常相似，病理學與MS也有明顯的相似之處[4]，也被研究者們認為是研究MS發病機制和藥物研發最佳模型之一[13]。這些模型既有相似之處，又有不同之處。有學者比較了敏感鼠SJL/J和C57BL/6J小鼠在病毒TEMV誘發脫髓鞘炎中的不同機制和表型，為研究脫髓鞘炎癥模型提供了更全面的了解。免疫和炎癥是研究眾多疾病的核心問題[14，15]。隨著研究的深入，更多的研究豐富了人們對MS致病機制的認知。有研究通過20年多發性硬化癥免疫調節治療的臨床經驗對適應性免疫在慢性、進行性神經退行性變是主要驅動因素的說法提出了質疑，認為多發性硬化癥中的慢性炎癥可能是組織駐留固有免疫細胞對CNS穩態失調的長期應激反應導致進行性和不可逆的神經退行性衰退[16]。然而TMEV在適應性免疫系統缺陷動物體內誘發硬化癥機制尚未見報道。本實驗選用了適應性免疫系統耗竭的NOD-SCID小鼠作為模式動物，試圖觀察適應性免疫耗竭的動物中，TMEV誘發腦脊髓脫髓鞘的病理和炎癥變化。結果顯示小鼠腦脊髓炎病毒誘導腦脊髓脫髓鞘（TMEV-I DD）在免疫缺陷鼠腦中出現了明顯的病理特征，并引起了共濟不調、癱瘓等神經障礙，與DePau la-Si lva等報道的TMEV-IDD模型描述一致[6]。

小膠質細胞與星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞組成了中樞神經系統的四種主要細胞類型。細胞串擾在MS病人海馬中已被證實，結果顯示海馬病理學在多發性硬化癥（MS）中廣泛存在，有研究揭示了海馬可能有助于未來治療MS記憶問題[17]。小膠質細胞是腦內一種特殊的單核吞噬細胞群，是中樞神經系統的常駐免疫細胞，是腦部炎癥和病理刺激的第一反應者[18]。越來越多研究將小膠質細胞作為MS生物標志物和潛在的治療靶點。小膠質細胞在MS具有雙重作用，通過“神經保護”和“神經毒性”表型變化影響MS脫髓鞘的發展或恢復。神經毒性小膠質細胞通過釋放活性氧化物和促炎細胞因子、抗原呈現、產生活性氧和氮物種（ROSINRS）等不同的機制損傷少突膠質細胞，最終導致神經退行性變的炎癥。促炎分子又作用于星形膠質細胞以促進鞘脂代謝、核因子NF-K B轉錄活性和細胞因子產生。Liddelow等[19]研究發現活化的小膠質細胞通過分泌TNF等來誘導A1型星形膠質細胞亞型，從而促進了神經退行性疾病中神經元和少突膠質細胞的死亡。慢性激活的炎性小膠質細胞被認為是神經變性的標志。STAT信號通路的過度表達直接導致運動神經元疾病的生理和病理結果，有研究發現JAK/STAT通路的異常激活在多發性硬化癥等神經炎性疾病中很明顯[20]。Yan[21]等發現TNF-d等細胞因子經過JAK/STAT信號傳導來觸發免疫反應從而過度激活大腦中的免疫反應。TNF-d是一種多效性促炎細胞因子，被認為是MS發病機制中的主要細胞因子和治療干預靶因子[22]。本研究發現在TMEV誘導的腦脊髓脫髓鞘炎中，與對照組小鼠相比，發生MS的免疫缺陷小鼠腦和海馬中表達更多的STAT3和促炎因子，且海馬中的小膠質細胞和星性膠質細胞顯著增殖。因此，本研究提示，TMEV通過激活免疫缺陷鼠中樞神經的STAT3途徑和促進炎性因子表達、炎性細胞增殖活化，從而促進了炎癥過程，最后導致了MS。本實驗模型的建立，為了解免疫缺陷條件下TEMV誘發MS的機制提供了新的視野。

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