熱休克蛋白在不明原因復發性流產中的研究進展*

王士萌，韓昕宇，亓丁，馮曉玲

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040 ；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

復發性流產（recurrent spontaneous abortion,RSA）是生育期婦女的常見疾病，是指與同一性伴侶連續發生≥2 次孕齡＜20 周的自然流產，其發病率呈逐年上升的趨勢，且風險會隨著流產次數的上升而增加[1]。RSA 臨床常見的致病因素常分為遺傳因素（染色體異常、孕婦高齡等）、內分泌因素（甲狀腺激素異常、肥胖等）、子宮解剖因素（先天或后天子宮畸形）、男性因素（精子異常、精索靜脈曲張等）、感染因素（全身或女性生殖道感染）及免疫紊亂因素等，除此之外仍有40%～60%的患者尚未明確病因，被稱為不明原因復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA）[2]。隨著研究的不斷深入，炎癥反應[3]、氧化應激、自噬誘導的細胞凋亡[4]、母胎界面免疫失衡[5]等因素也會導致不良妊娠結局，造成URSA 的發生。近年來關于熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）在女性生殖疾病母胎中的作用已得到廣泛認可[6]。本文就HSPs 在妊娠中的作用機制以及其與URSA 的研究進展進行綜述，以期為URSA 疾病提供新的治療靶點。

1 HSPs概述

HSPs 是一類高度保守的分子家族，是生物細胞在應激狀態下啟動合成的蛋白質，最早是TISSIèRES等[7]通過放射自顯影技術在果蠅熱休克反應狀態下的唾液中分離出來。基于系統基因符號可將HSPs 進一步分為以下家族，即HSPB（SmallHSP）、DNAJ（HSP40）、HSPD/E（HSP60/HSP10）和CCT（TRiC）、HSPA（HSP70）、HSPC（HSP90）和HSPH（HSP110）。目前大分子質量HSP 以腺苷三磷酸依賴方式促進跨膜共翻譯，而小分子質量HSP 不依賴腺苷三磷酸。

HSPs 常作為分子伴侶廣泛存在于原核生物和真核生物中，并參與其蛋白質的折疊[8]。HSPs 在改善細胞對不利條件的抵抗力方面發揮著重要作用，例如，在生理應激期間（如組織分化、生長和激素刺激）保持蛋白質結構和功能，維持蛋白質穩態[9]；在病理應激期間（如高溫、缺氧缺血、炎癥反應等有害刺激），HSP 家族成員及其釋放出的熱休克轉錄因子表達調控，協同免疫，減少細胞的損傷及凋亡[10]。

2 HSPs 在妊娠生殖中的作用及與發生URSA的機制

HSPs 已被發現與蛻膜、著床和胎盤有關，其失調與著床失敗、妊娠丟失和其他母胎并發癥的發生密切相關。有學者在回顧性研究中論述了HSP家族不同成員在妊娠期間的作用：HSP27 促進蛻膜化及子癇前期發病；HSP40 損害早產相關機制，促進子癇前期發病；HSP60 誘導類固醇激素，特別是孕酮的合成，促進胚泡發育；HSP70 保持蛻膜細胞完整性，在蛻膜樹突狀細胞中誘導“促炎癥成熟程序”，促進胚泡發育，保護胚胎免受高溫的致命影響；HSP90 促進類固醇受體的成熟和識別；HSC70 調節蛻膜化人胚胎干細胞的容受性，促進蛻膜化，誘導人胚胎干細胞內質網應激；GRP78 應對內質網應激，促進激活合胞體；HSP105 支持胚胎植入[11]。

2.1 HSPs調節母胎界面免疫細胞功能

妊娠過程可以說是同種半異型體胎兒的移植過程，母胎界面良好的免疫耐受狀態可確保胎兒免受母體免疫系統對父系白細胞抗原攜帶抗原的攻擊。蛻膜自然殺傷細胞、T 淋巴細胞、巨噬細胞等共同構成母胎界面免疫耐受的免疫細胞。HSPs參與自然殺傷細胞的激活，并介導其對應激狀態的反應，在免疫應答中發揮重要作用。

2.1.1 HSPs 對自然殺傷細胞的調節作用自然殺傷細胞又稱NK 細胞，其分為外周血NK 細胞和蛻膜NK 細胞，蛻膜NK 細胞在妊娠早期迅速增加，促進胎盤發育過程中的血管生成和滋養層侵入，相反，外周血NK 細胞在正常妊娠受精卵植入后呈下降趨勢，而RSA 患者外周血NK 細胞CD56+/CD16+升高，細胞毒性增強，均可損傷妊娠組織，造成反復流產[12]。

HSP70 衍生肽可誘導純化NK 細胞的趨化性和細胞毒性，膜結合型HSP70 對NK 細胞具有免疫刺激作用，而細胞質高水平HSP70 會干擾細胞凋亡通路從而介導治療抵抗[13]。NK 細胞上HSP70 的受體CD94，具有介導HSP70 刺激NK 細胞增殖和活性的能力[14]，在RSA 患者和體外受精失敗女性中的表達顯著增加[15]。此外，有研究表明內質網駐留的GP96/GRP94（HSP96）能夠觸發NK 細胞反應[16]，使外周血NK 細胞活性增強，并伴隨CD56+NK 細胞群擴大及γ 干擾素分泌增加。

2.1.2 HSPs 對T 淋巴細胞及巨噬細胞的調節作用T 淋巴細胞包括輔助性和調節性T 淋巴細胞，抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞和巨噬細胞及其各自亞群，調節性T 淋巴細胞在妊娠期間數量和活性的下調會導致流產，對母-胎免疫耐受的建立至關重要。HSP60 通過激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）和TLR2 調節先天免疫系統，對調節性T 淋巴細胞表現出抗炎功能，促進巨噬細胞M2 表型功能及腫瘤壞死因子α、白細胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、IL-12、IL-15 等炎癥因子分泌，在孕婦血清中含量增加，與增強胎兒耐受性的免疫抑制有關[17]。HSP70、HSP90 亦可誘導巨噬細胞產生促炎因子調節免疫平衡。

2.2 HSPs調節子宮內膜蛻膜化

子宮內膜間質室中細長的成纖維間充質細胞轉變為特殊的圓形上皮蛻膜細胞稱為蛻膜化。妊娠母體子宮內膜廣泛重塑，胚胎干細胞通過卵巢類固醇激素作用，發生形態學、生化和代謝改變，對胚胎識別和黏附、滋養層侵襲、胎盤形成至關重要，保護發育中的胚胎免受母體免疫監測，并為其提供營養援助，蛻膜化異常可導致子宮內膜和妊娠并發癥，致使流產發生。HSPs 在蛻膜化過程中以改變子宮內膜容受性和誘導結合蛻膜細胞的相關受體為主。

HSPA8（即HSC70/HSC71/HSP71/HSP73）在正常蛻膜化人胚胎干細胞中高表達，而與發育受損的胚胎相互作用期間，微陣列分析發現HSPA8基因下調最為顯著，致使蛻膜化時子宮內膜容受性降低[18]。HSP70 誘導結合蛻膜CD1a+樹突狀細胞上的CD91 和TLR4 受體，參與促炎性成熟程序，誘導蛻膜細胞成熟，并同時合成IL-15[19]。

李慧芳等[20]研究發現RSA 小鼠蛻膜中HSP27 表達相比于正常小鼠明顯升高，使用中藥壽胎丸調控其表達可降低胚胎丟失率。GULIC等[21]發現稽留流產和胚胎停育患者蛻膜組織切片中內質網駐留蛋白GP96 侵入滋養層細胞，免疫熒光染色結果顯示GP96 蛋白表達強于正常早孕女性，與受體CD91 和TLR4 結合后可能誘導有害免疫反應。母胎界面釋放GP96 后，滋養層和蛻膜細胞中CD91 和TLR4 的表達在分娩起始和病理性早孕終止的生理機制中發揮重要作用，抗原呈遞CD1a+未成熟樹突狀細胞、CD83+成熟樹突狀細胞、CD14+巨噬細胞及早孕蛻膜中CD3+CD56-T 和CD3-CD56+NK 細胞可能是GP96 的相關作用靶點。

2.3 HSPs參與自噬、細胞凋亡

HSPs 在子宮內膜、蛻膜、輸卵管、胎盤等生殖組織中均有表達[22]。在妊娠過程中HSP70 廣泛存在于滋養層細胞、內皮細胞的細胞核和細胞質中，抑制妊娠母體過度自噬，其濃度與預防細胞衰老和凋亡密切相關。

自噬是一種高度保守的進化過程，可清除受損的細胞器和外來病原體以維持細胞穩態，自噬失調是導致自然流產的機制之一。有研究通過酶聯免疫吸附試驗檢測212例孕婦外周血單核細胞中p62 的濃度以反映自噬程度，結果顯示p62 濃度與自噬程度呈負相關，且隨著先前活產、早產或足月分娩次數的增加而增加，細胞內HSP70 濃度與p62 水平存在強相關性，提示HSP70 可作為自噬抑制劑調節妊娠期間外周血單核細胞的自噬程度[23]。此外，經產婦外周血單核細胞中HSP70 的水平高于未產婦，說明與首次暴露于胎兒抗原的未產婦相比，經產婦妊娠相關免疫和生理反應的重新激活可能會引發更強烈的應激反應，通過誘導外周血單核細胞產生HSP70 以限制妊娠期間的自噬能力，具有下調促炎免疫和維持胎兒健康的重要作用。

正常妊娠依賴于胎盤和蛻膜組織細胞增殖、凋亡之間的動態平衡，由多種原因引起的細胞凋亡異常可能會導致妊娠失敗或病理妊娠[24]。1 項關于HSP70 異常表達與自然流產關系的臨床研究中，分別收集50例自然流產和人工流產患者的蛻膜組織，觀察到自然流產組的細胞凋亡率、HSP70 蛋白及mRNA 表達量均顯著高于人工流產組[25]。HSP70的過度表達可引發蛻膜組織缺血、胚胎生長受限和免疫細胞過度刺激，其介導凋亡的機制是經線粒體信號通路形成凋亡小體或激活JNK 信號通路[26]。HSP70 還可保護細胞免受活性氧誘導的DNA鏈斷裂和脂質過氧化的影響，抑制凋亡介導的細胞死亡過程，保護細胞免受腫瘤壞死因子α 介導的炎癥效應和細胞毒性作用。

2.4 HSPs調節內質網應激

任何引起蛋白分泌負荷增加的因素及病理狀態下突變蛋白的存在，均可使細胞質中蓄積錯誤折疊或未折疊蛋白，此狀態為內質網應激。妊娠女性內質網應激狀態會誘發胎盤滋養細胞生物學行為異常，影響內質網維持胎盤轉運代謝的功能。

GALGANI等[27]在內質網應激與子宮內膜容受性缺陷的研究中發現，子宮內膜中葡萄糖調節蛋白78 水平升高是URSA 胚胎植入缺陷的原因之一，其隸屬HSP70 家族，是未折疊蛋白反應的主要調節者，與α2-巨球蛋白相互作用調節滋養層細胞融合[28]，促進胎盤形成的合胞化過程，在應激和缺氧條件下，與p53 蛋白共表達于滋養層細胞表面，并作為分子伴侶參與p53 的失活和穩定，從而調控下游靶基因，引起細胞周期停滯及凋亡。

HSP47 是定位在內質網上的膠原蛋白特異性分子伴侶，由SERPINH1基因編碼，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，通過與免疫球蛋白結合蛋白的競爭或結合，促進肌醇酶1α 的激活以減少內質網應激的發生[29]。HSP47 生成障礙會導致膠原蛋白合成異常或錯誤折疊，使基底膜發生不連續斷裂，此外，HSP47 基因敲除可導致細胞凋亡標志物CHOP 的表達上調[30]，均可致胚胎死亡。

2.5 HSPs參與生殖細胞發育及精子調節

精液參數水平影響胚胎早期分化發育。有前瞻性研究通過蛋白印跡法比對16例反復妊娠丟失男性和20例正常男性的精液樣本差異表達蛋白，結果顯示反復妊娠丟失男性精子中睪丸富集熱休克蛋白（HSPA2）呈低表達[31]。這歸因于精子內非正常組蛋白修飾導致氧化應激[32]，使HSPA2 蛋白化學烷基化，與重組蛋白SPAM1 和ARSA 協同作用，使精子透明帶結合或穿透異常，造成受精后胚胎發育障礙。HSPA2 在精索靜脈曲張或弱精癥患者精子中表達不足，提示與射精濃度存在強相關性，可影響精子在女性生殖道上升過程中的功能轉化，造成特發性精子-卵母細胞識別障礙[33]。HSPA2 通過聚集絲裂原活化激酶級聯的特定成分，選擇性介導JNK 信號通路，使支架蛋白JIP4 在反復妊娠丟失男性精子中過表達[31]，提示熱休克蛋白突變的信號轉導途徑可能是早期胚胎發育質量的影響因素。

此外，精子DNA 的完整性決定受精后胚胎形成、著床及子代健康，精子DNA 損傷機制主要為凋亡、氧化應激及核染色質“濃縮”異常。睪丸過熱或病理及應激狀態下睪丸中活性氧濃度升高也會破壞精子細胞核的完整性。HSP90 參與調控生精細胞減數分裂，對阻礙生殖功能的內、外源性生物活性物質具有清除能力，可避免因DNA 損傷而引起精子細胞周期阻滯。HSP90 家族成員TRAP1可影響活性氧的產生部位或加快其分解，抑制濃度過量引發的精子細胞死亡[34]。HSP90 還可激活一氧化氮合酶，產生在細胞信號肽中充當抗氧化劑或自由基作用的一氧化氮以保護精子[35]。

2.6 HSPs與雌孕激素水平相關

體外受精和胚胎移植時期高濃度血清雌二醇可損傷子宮內膜容受性，干擾內膜成熟并降低胚胎植入率，可能是由于超生理水平的雌二醇下調子宮內膜上皮細胞核轉錄因子NF-κB 的激活狀態所致。CHEN等[36]實驗證明HSP70 是子宮內膜上皮細胞高雌二醇信號通路中NF-κB 的上游調節蛋白。分離子宮內膜上皮細胞并培養于高濃度雌二醇中，發現高濃度雌二醇可結合雌激素受體，增強熱休克因子HSF-1 活性，增加HSP70 表達。誘導型HSP70 與IκB 激酶γ 形成復合物并降低激酶活性，抑制子宮內膜上皮細胞中IκB 激酶α 磷酸化，抑制核內轉化生長因子β1介導NF-κB 活化，導致子宮內膜上皮細胞凋亡。

孕酮是一種類固醇激素，由膽固醇從細胞質運輸到線粒體內膜合成，胎盤中孕酮的合成可為胚胎植入子宮內膜做準備，并維持妊娠至足月，早孕母體血清中孕酮值過低是先兆流產的征兆。人胎盤絨毛膜癌細胞系可高表達特定的類固醇生成酶，目前被廣泛用于胎盤類固醇生成。JESSICA等[37]發現HSP60 定位于人胎盤線粒體接觸位點，與STARD3 和P450scc 蛋白相互作用，以劑量依賴性方式結合膽固醇，在人胎盤絨毛膜癌細胞中過表達，刺激孕酮合成，此結果在非類固醇生成的人胚胎腎293 細胞系中被證實。

2.7 HSPs參與同型半胱氨酸代謝

妊娠女性葉酸缺乏或葉酸代謝基因異常可引起同型半胱氨酸堆積，高同型半胱氨酸血癥對胚胎有毒性作用，可破壞機體凝血功能及纖溶系統，損傷血管內皮形成微血栓，抑制絨毛膜形成，引起胚胎著床不良而致流產[38]。HSP27 在同型半胱氨酸代謝途徑中發揮保護機體的正向作用。血清HSP27 水平與動脈粥樣硬化程度呈負相關，田欣[39]研究發現HSP27 可減弱同型半胱氨酸對內皮細胞表達一氧化氮的影響，抑制黏附分子和趨化因子mRNA 表達，減弱同型半胱氨酸誘導的內皮細胞損傷。此外，高水平HSP27 可促進線粒體凋亡相關蛋白B 淋巴細胞瘤-2 表達，抑制Bax、下游Caspase-3活化和PARP 裂解，抑制同型半胱氨酸引起的內皮細胞凋亡，起到細胞保護作用。

3 HSPs與妊娠相關疾病

HSPs 是哺乳動物受精后最先產生的蛋白質之一，可促進胚胎線粒體中的孕酮合成或與胚胎存活相關的植入前因子結合[40]，在妊娠早期胚胎和母體蛻膜中持續表達以維持細胞內蛋白質的完整性。HSP70 隨著妊娠進展而逐漸增加，參與并調節適應性免疫應答過程，觸發胎兒免疫耐受，這在一定程度上對胎兒有利。但當HSP70 增加達到閾值后，會大量沉積于胎盤絨毛膜中，使自噬失調而致流產[41]。MATSUDA等[42]探究RSA 非妊娠女性血管功能障礙的嚴重程度與抗HSPs 抗體的相關性，發現抗磷脂抗體陽性的RSA 患者或抗磷脂綜合征患者的抗HSP60、HSP70 抗體水平均顯著升高，但與血管僵硬指數（臂踝脈搏波速度、頸動脈增強指數）無相關性，還需進一步探究抗HSPs 抗體在RSA 血管功能中的病理、生理機制。

MAKRI等[43]研究發現妊娠12 周前，HSP60/HSP70 的比值≥6，流產風險增加，且HSP60 和HSP70 的比例失衡是由于母體或胚胎組織自身釋放失調所致，與后期其他因素所致的生物合成無關。有研究發現未足月胎膜早破患者的胎盤中央區HSP60 和HSP70 的基因表達水平明顯高于正常妊娠女性，而胎膜完整早產患者和正常妊娠女性之間未發現類似差異[44]，提示妊娠晚期HSP60 與HSP70的增高可能會可誘發胎膜破裂導致早產。

4 總結

綜上所述，HSPs 可調節母胎界面免疫、細胞自噬與凋亡、子宮內膜蛻膜化等多種維持成功妊娠的相關因素，在滋養細胞侵襲、胎盤形成及胚胎植入等生理妊娠過程中發揮重要作用。HSPs 可作為一種反映胚胎生育能力、預測妊娠結局的生物學指標，具有成為治療反復妊娠失敗新靶點的潛在作用。目前關于HSPs 與URSA 的直接研究較少，需要進一步探索以明確和證實其參與病理妊娠的分子機制，同時為其他妊娠相關疾病的機制研究和預防治療提供新思路。