慢速與快速生物監測理論與實踐研究進展

伴隨著科學技術的飛速發展和全球人口老齡化的進程加劇，全球醫療機構正在面臨前所未有的診療服務壓力。院內感染的有效控制作為提供服務的先決條件，自始至終都是醫療機構日常工作的重中之重[1]。消毒供應中心作為醫療機構中承擔各科室所有重復診療器械、器具和物品清洗、消毒、滅菌以及無菌物品供應的部門，在很大程度上決定著可能由醫療器械、器具和物品等引發的院內感染幾率高低，是院感控制的關鍵科室，因此，其每一個操作步驟都應該引起院感管理者的充分重視[2]。滅菌作為徹底殺滅器械表面、內部等結構中殘留微生物的再處理操作，是消毒供應中心器械無菌儲存與發放前的最后一個操作步驟，更是保護器械再處理質量的最后一道“屏障”。我國衛生行業標準《WS 310.3-2016 醫院消毒供應中心 第3部分：清洗消毒及滅菌效果監測標準》[3]提出，針對器械滅菌，應按照不同滅菌方式所要求的監測頻率，進行滅菌效果的生物監測，生物監測結果不合格時，對應滅菌器械不予放行。目前，醫療機構所使用的生物監測方式，按照監測時間、判讀原理等原則區分，存在著慢速和快速生物監測兩種類型，其在得到廣泛使用的同時，對應的可靠性問題引起了業內的普遍關注，其可以直接影響到醫療機構器械再處理的效率和院感控制的風險。文章對該領域進展綜述如下。

1 慢速與快速生物監測的發展

1881年，德國醫學家Koch[4]首先針對引發炭疽熱感染的、對滅菌條件產生較強抗力的細菌芽孢進行研究，其提出天然土壤中的芽孢相較炭疽桿菌適宜培養基中產生的芽孢對于滅菌條件有更強的抗力，自此，相關科學家逐漸形成共識：如果一種滅菌方式能夠殺滅抗力最強的細菌形式，可以認為其能夠殺滅其他的生命體形式，此即為生物監測的設計理論基礎。經過長時間的發展，1957年，全球首個商業化的生物指示物問世并被應用于醫療機構[5]。首先推廣使用的是第一代生物監測產品，其對應的生物指示物將已接種的菌片置于包裝中，隨后統一放入滅菌設備中進行滅菌，在無菌條件下實現生物指示物的取出和培養，時間需要7 d，以培養基的渾濁狀態為滅菌結果的判定標準。

第二代生物監測產品，其設計采用自含式包裝方法，將已接種的菌片和培養基同時封裝于一個初級包裝中，在滅菌之前兩者互不接觸，滅菌后不需無菌條件操作，培養時間通常為1～7 d，以培養基顏色變化為滅菌結果的判定標準，由于培養時間仍需要1 d以上，因此其被認為是普遍意義上的慢速生物監測。第三代生物監測產品，其包裝方法與第二代產品相同，通過培養基體系中非熒光化合物的添加，實現培養時間的縮短，通常在數小時甚至1 h內，以機器判讀的熒光反饋結果為滅菌結果的判定標準，由于可以實現極高的判讀效率，其被認為是普遍意義上的快速生物監測。

第一代生物監測產品由于需要為期7 d的微生物培養，無法滿足目前醫療機構器械使用快速周轉的需求，在一線消毒供應中心中已停止使用。慢速生物監測產品能夠在很大程度上縮短微生物培養時間，同時判讀方式比較簡單直接。因此，其在醫療機構中得到了長期廣泛使用。快速生物監測產品在判讀時間上真正幫助醫療機構實現了快速的滅菌周轉和有據放行，目前正在整個行業內逐步替代慢速的生物指示物。

2 慢速與快速生物監測判讀原理及驗證要求

慢速生物監測以自含式生物指示物內培養體系中的酸性物質為考察對象，如果其含量達到一定濃度，可以使預先存在于液體培養基中的酸堿指示劑發生視覺上可以觀察到的顏色變化，進而指示滅菌結果。酸性物質為細菌整個生長周期中主要的代謝產物，不同細菌根據產酶種類的不同，對培養基中主要的糖類或醇類供能物質進行針對性發酵，用于自身供能，同時產生酸性代謝產物，部分細菌同時會產生氣體代謝物。快速生物監測以自含式生物指示物內熒光物質為考察對象，首先使用特定外置光源對自含式生物指示物細菌培養區域進行激發，熒光物質受激發后發出的熒光可以被熒光接收器捕捉，進而通過機器后臺計算指示滅菌結果。熒光物質由培養體系中非熒光底物轉化生成，而根據相關研究[6-9]，目前非熒光底物的轉化主要通過微生物糖類代謝中的重要物質α-葡萄糖苷酶或β-磷酸葡萄糖苷酶實現。

美國FDA在《Guidancefor Industryand FDA staff：Biological Indicator（BI）Premarket Notification [510（k）] Submissions》中提出，“通常情況下，FDA推薦7 d作為生物指示物指示滅菌程序的傳統培養時間”“一個生物指示物的培養時間可以少于傳統的7 d甚至更長的培養時間，前提是根據合適的方法驗證出的縮短后的培養時間對于判定滅菌過程有效性是充分的”[10]。在該指南中，FDA推薦了相關的方法以及最低的批次陽性率一致性要求。Laszlo等[10]對FDA推薦的驗證方法進行了詳細的分析闡述，其認為FDA使用的“Most Probable Number”假設方法（MPN法）是具有統計學依據的，其規定的97%及以上的批次一致性能夠很好地保證指示效果。我國衛生行業標準《WS628-2018 消毒產品衛生安全評價技術要求》中，生物指示物的必檢項目中并未包含指示結果一致性對比。但從實際情況來看，目前我國行業內生物指示物的安評報告中均已加入了縮短后的培養時間和7 d培養結果的一致性對比。

3 慢速與快速生物監測應用爭議

目前，行業內對于慢速生物監測的判讀原理及指示結果的認可度較高。以常見的壓力蒸汽滅菌生物指示物為例進行分析，根據相關研究，其選用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為標的微生物，該菌種在代謝過程中中產酸不產氣。該體系中，培養基通常選用pH值為7.2的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養基[11]。溴甲酚紫作為常見的酸堿指示劑，其指示條件為pH值＞6.8時顯示紫色，pH值＜5.2時顯示黃色[12]。對于自含式生物指示物，由于其可以在一定程度上做到有效的污染物屏蔽，因此可以確信培養體系pH值的大幅降低是細菌生長過程中產生的酸性代謝產物造成的結果。

同時，行業內對于快速生物監測的應用存在爭議，問題的焦點主要集中于和判讀原理相關的幾個方面。

3.1 特種酶和芽孢生理活動的對應關系

以壓力蒸汽滅菌生物指示物所用嗜熱脂肪芽孢桿菌為例，其產生α-葡萄糖苷酶用于非熒光底物糖苷鍵的切斷。α-葡萄糖苷酶對于微生物的糖類代謝具有重要作用，其在幾乎所有的生命體內均廣泛存在，在成熟細胞中含量較高[13]。Mphahlele等[14]通過研究表明微生物產生的α-葡萄糖苷酶可以分為胞內酶、細胞結合酶和胞外酶3種類型。根據考慮到自含式生物指示物菌片負載芽孢的制備工藝，在產品使用之前，載體菌片上很有可能是同時含有以上3種類型。

Peytam等[15]對于α-葡萄糖苷酶的活性進行了深入研究，其發現胞外酶會在98℃、30 min的熱激活條件下損失絕大部分的活性，考慮到目前一線臨床使用的滅菌器程序，可以認為經歷完整滅菌程序的載體菌片上胞外酶已完全失去活性，同時，其發現α-葡萄糖苷酶同時存在于位于不同生理周期的芽孢的外層芽孢被、內層芽孢被和芽孢核中，如果胞外酶已經完全失去活性，則芽孢必須向胞內攝取糖類底物才能發揮α-葡萄糖苷酶的水解特性。Hussain等[16]通過免疫電鏡觀察到對于休眠狀態下的嗜熱脂肪桿菌芽孢，α-葡萄糖苷酶主要位于芽孢原生質外的芽孢被中。Laaroussi等[17]研究顯示α-葡萄糖苷酶的最適溫度為80℃以下，因此在真實的滅菌條件下，假設芽孢的整個細胞結構，包括含有遺傳物質的芽孢核、芽孢皮、芽孢內外胞被統一破壞，則α-葡萄糖苷酶也會因為失去結構保護而快速失活；假設芽孢的部分結構被破壞，此時芽孢殘留完整結構中的α-葡萄糖苷酶依然有可能發揮催化作用。

3.2 慢速和快速生物監測指示結果一致性

結合微生物培養時間相關文獻研究及中美不同地區實際要求[15-19]，可以認為無論是慢速生物指示物還是快速生物指示物，其對應培養時間均非權威認定的時間標準，在生物指示物上市前，均有必要進行一致性驗證試驗。吳千惠等[5]的研究顯示，402次快速生物監測與慢速生物監測結果具有高度一致性，且快速生物監測能夠顯著提升監測速度，降低監測成本。但也有研究報道，慢速和快速生物監測指示結果出現不一致是被接受的情況[20-21]。

對于慢速生物監測，指示物的變色需要依托以下兩個過程：（1）存活芽孢在合適的生長環境下，進行活化、出芽、生長和繁殖等一系列生理活動，向環境中分泌大量的酸性代謝產物；（2）足量的酸性代謝產物引起的pH變化足夠跨越顯色劑的變色區間。對于快速生物指示物，閱讀機器通過預先的程序設定，對于早期的熒光捕捉具有高度敏感性，此時體系中對應的芽孢數量較少，生理周期也處于早期階段。

慢速和快速生物監測結果不一致的情況，往往表現為慢速指示結果陰性、快速指示結果陽性的情況。針對此類情況，第一種可能性是滅菌過程有效性處于臨界狀態，體系中殘留的、具有活性的芽孢數量極少，其無法通過規定時間內的培養達到足以使慢速生物指示物變色的微生物數量[22]；第二種可能性是體系內有少量殘留芽孢且其部分結構已經被破壞，同時還有殘留α-葡萄糖苷酶或芽孢依然在合成α-葡萄糖苷酶；第三種可能性是體系內所有芽孢已經滅活，全部結構被破壞，同時還有殘留α-葡萄糖苷酶[23]。通過前述分析，第三種可能性發生概率極低，滅菌的整個過程必須經過非常精細的條件設計和真實呈現才會形成此類情況。

3.3 陽性判讀結果的認知

劉晨鳴等[24]的研究分析，對于慢速生物監測，當有陽性監測結果呈現時，體系內同時已經含有大量的處于對數期、穩定期的細菌，提示對應滅菌過程不能提供所要求的滅菌保障水平。而對于快速生物監測，首先，其監測結果已經按照不同要求與7 d培養結果進行一致性的對比，雖然其可能同慢速監測結果不符，但理論上應該以7 d監測結果的對比數據為準[25]。其次，雖然其可能在后續的慢速培養中顯示陰性結果并提示芽孢無法完成正常的細菌生理周期，但指示標準菌種的殘留已提示出器械可能表面微生物殘留，其是否能在人體環境下完成生理周期并顯示致病性應該引起重視。最后，有條件的醫療機構應該通過相應的檢驗方法確定指示物中芽孢的殘留情況和生理狀態。

4 快速生物指示物的應用現狀

自快速生物指示物問世以來，許多醫療機構都將其應用于日常滅菌監測及科學研究當中。蔡海燕[26]通過為期6個月的試驗對比，證實快速生物指示物能夠明顯縮短器械周轉時間和生物監測陽性召回工作量，而不同型號的生物監測產品無統計學意義上的陽性率差異；尹翔宇等[27]通過分析科室生物監測失敗的原因，認為快速生物監測能夠給臨床帶來極大便利，但需要通過嚴格規范操作來確保得出準確的監測結果，避免“假陽性”事件的發生；馬仕洪等[28]通過對比試驗發現傳統的菌片式生物指示物容易受到污染物影響，而其他多個品牌的慢速及快速生物指示物能夠避免“假陽性”結果的產生，且指示結果之間沒有明顯差異。萬莉等[29]在對快速生物指示物的應用過程當中，給予了其高度評價，該團隊認為可能的“假陽性”結果和滅菌器的性能有密切關系。

5 小結

綜合分析相關國內外研究文獻，慢速與快速生物監測均具備相當的且合理的理論基礎，且正在被國內外醫療機構廣泛應用于日常工作和科學研究當中，為相關單位提升器械再處理水平、提高器械再處理質量和降低院感事件發生率做出了相應的貢獻，應當針對其使用價值給予肯定。與此同時，行業內出現的應用爭議主要在于困擾一線臨床使用者的監測結果準確性問題，慢速與快速生物指示物的監測結果同微生物殘留水平的對應關系還無法做到實時驗證，如何規范檢測水平、開發實時微生物檢測技術也是下個階段需要研究人員深入探索的問題。