觀賞園藝植物遺傳圖譜中分子標記技術的研究進展

蔣錦雷

（濮陽市農業農村局，河南 濮陽 457000）

分子標記在遺傳學這門學科發展過程中有著至關重要的作用，同時也是觀賞園藝植物遺傳育種的重要工具。隨著遺傳學學科的縱深發展，遺傳標記的種類和數量也在不斷擴充，主要種類包括形態標記、細胞學標記、DNA 標記和生化標記4 類。其中DNA 標記是分子水平遺傳變異的直接反映，而其他三類標記都是對基因的間接反映，并且對植物各發育階段都能進行精準的分子鑒定，其數量豐富且結果可靠性高。

1 兩大類分子標記技術原理和特點

DNA 分子標記是分子水平上遺傳多態性的直接表現。生物技術的進步和科研成果的運用，為觀賞植物遺傳育種提供了基于DNA 多態性的分子標記，該技術的重要性早已被觀賞植物育種領域所公認，其應用突出表現：直接以DNA 多態性形式表現，對觀賞植物個體各個生長發育時期的細胞均可檢測，不受時間、環境、取樣部位等條件限制，且可覆蓋到整個基因組[1]。鑒于多方面的優越性，現已大量地應用于觀賞園藝植物分子育種研究[2]。

1.1 基于Southern技術類標記

該技術是利用限制性內切酶對各類DNA分子片段酶切后，用特異性探針進行Southern雜交技術，再通過放射自顯影技術或非同位素顯色來證明DNA分子的多態性。其中表現最典型的是發現最早的RFLP（restriction fragment length polymorphisms）標記，它屬于共顯性標記，呈孟德爾式遺傳，結果穩定可靠，特別適合于建立連鎖圖譜，不足是RFLP探針的開發費用較高[3]。

1.2 基于PCR技術類分子標記

RAPD（random amplified polymorphic DNA）標記。設計的隨機引物由10 個堿基組成，由該引物對樣品的全基因組進行PCR 擴增，獲得DNA 多態性條帶。其具有分辨率高、簡單、成本低等優點，因隨機擴增基因組而致使其穩定性較差[4]。

SSR（simple sequence repeats）標記。該標記利用簡單序列重復次數的差異設計引物，利用該引物一般檢測到單一的多等位基因位點，而開發SSR 引物前期費用較高[5]。

AFLP（amplified fragments length polymorphism）標記。通過選擇性擴增基因組DNA 的酶切片段，為共顯性或顯性，穩定性強，結果可靠[6]。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）標記。該標記利用基因外顯子里GC 含量不同，同時啟動子和內含子里AT 含量不同的特點來設計引物，利用該引物對不同材料的ORFs（open reading frames）進行擴增，擴增出多態DNA 條帶，具有簡便、穩定、便于克隆目標片段等特點[7]。

EST（expressed sequence tags）標記。該標記是通過對cDNA 文庫隨機擴增，進而對所得的cDNA 不同端序列進行測序，一般長度為150 bp～500 bp，易于開發[8]。

TRAP（target region amplified polymorphism）標記。該標記依據生物信息學及表達序列標簽（EST）數據庫DNA 信息，找出目標候選基因區，對照設計不同DNA標記[8]。

2 遺傳圖譜中常見分子標記技術的應用

1）RAPD 標記。Debener 等[9]通過運用305 個RAPD 分子標記、AFLP 分子標記構建了一張觀賞植物玫瑰的連鎖圖譜。Peltier 等[10]利用RAPD 分子標記和形態學標記手段構建了一張觀賞植物矮牽牛BC1群體的分子圖譜，有7 個連鎖群，覆蓋基因組長262.9 cM，平均圖距為8.2 cM。謝偉等[11]利用RAPD 分子標記對春蘭、春劍、蕙蘭進行了分子研究，構建它們的DNA 分子指紋圖譜，并進一步探究了它們的親緣關系。黃翠娟[12]利用RAPD、SSR 兩種分子標記，以F1雜交群體為材料，構建了觀賞植物梅花的分子圖譜。黃少玲[13]利用RAPD 標記構建了一張春石斛分子遺傳圖譜，圖譜包含9 個連鎖群、121 個標記位點，其總長度為6 568.7 cM，標記間平均距離為50.11 cM。

2）SSR 標記。胡興華等[14]以1 個茶花品種為試材研究不同體系，利用SSR 標記構建茶花分子指紋圖譜。于超[15]以月季四倍體為材料，構建7 個連鎖群，包含295 個多態性位點，總圖距為874 cM，平均圖距為2.9 cM。

3）ISSR 標記?？姾惚虻萚16]利用ISSR 標記進行PCR 擴增，獲得多態性譜帶114 條，并利用標記多態性構建了菊花的指紋圖譜。葛亞英等[17]利用12 條ISSR 引物，以41 個麗穗鳳梨品種為材料，構建了麗穗鳳梨品種的分子指紋圖譜。

4）SRAP 標記。潘俊松等[18]以黃瓜自交系S06 與S52 雜交產生的F2群體（共93 個單株）為作圖群體，應用SRAP 標記構建觀賞黃瓜的分子遺傳框架圖譜。Gao 等[19]利用92 對SRAP 標記，以白姜花與圓瓣姜花雜交的F1個體為材料，構建兩張中等密度的父母本的遺傳圖譜，其中母本連鎖圖有18 個連鎖群，包含139 個標記，總長917 cM；父本的連鎖圖有23 個連鎖群，包含203個標記，總長1 386.8 cM。Sun等[20]利用SRAP標記對梅花的圖譜進行了連鎖研究。

5）多種標記的綜合應用。以下綜述了常見的十種觀賞園藝植物的分子圖譜構建中多種分子標記的聯合應用研究。Li 等[6]以羽衣甘藍與花椰菜的86 個RI 系個體為作圖群體，利用SRAP 標記、AFLP 標記作圖，構建了羽衣甘藍的分子圖譜。Zhang 等[21]利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標記初步構建了菊花的遺傳連鎖圖譜，共有567 個標記。張飛[22]以142 個F1為作圖群體，利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標記，分別構建菊花父母本遺傳圖譜。Bossolini 等[23]以兩個種間矮牽牛雜交個體為作圖群體，運用SSR 標記、AFLP 標記構建了矮牽牛的分子圖譜，圖譜總長分別為970 cM和700 cM。潘宏兵[24]利用8個SSR標記、28個ISSR 標記和194 個SRAP 標記，構建了石斛遺傳連鎖圖，該圖譜有26 條連鎖群，總圖距為1 548.9 cM，平均圖距為9.91 cM。王萬興[25]利用SSR、SNP 標記對結球甘藍的DH 群體進行了遺傳圖譜構建，覆蓋基因組總長度為1 197.9 cM，平均遺傳距離和物理距離分別為0.98 cM 和503.3 Kb。唐楠[26]對郁金香的圖譜研究表明，母本連鎖群有27 條，包含110 個SNP 標記、2個SSR標記、238個AFLP標記，總圖距為1 707 cM，平均圖距為3.9 cM；父本連鎖群有21 條，連鎖群含有99 個SNP 標記、3 個SSR 標記、190 個AFLP 標記，總圖距為1 201 cM，平均圖距3.1 cM。Venkat 等[27]采用Anthurium ornatum“A1”和Anthurium“Eternity”雜交的41 個F1代單株用于遺傳作圖，共使用三種標記，其中有RAPD 標記99 個、ISSR 標記21 個和SRAP 標記108 個，對兩個紅掌親本分別構建圖譜，母本的圖譜圖距為1 233.5 cM，而父本的圖譜總圖距為1 023.5 cM。蔡長福[28]采用牡丹的F1代群體中195 株單株為作圖群體，利用SLAF、SSR 標記，構建了牡丹的分子連鎖圖譜，該圖譜總圖距為1 061.94 cM，平均圖距為0.84 cM。

3 存在的問題及展望

分子標記已經被廣泛應用于遺傳育種中。隨著分子生物學的進一步發展，分子標記技術在觀賞園藝植物育種領域的運用將更加廣泛。但是現在大多數試驗僅停留在少數幾種標記技術的應用，在以后的研究中如果能把多種標記同時用在一個試驗中，就會構建出飽和度更高的遺傳圖譜。SRAP 和TRAP 標記系統是簡便、高效的標記系統，易于實現自動化，在一次實驗中可產生大量的多態性片段。SRAP 標記可以和RAPD、AFLP 等其他分子標記相結合，構建大多數觀賞園藝植物高度飽和的遺傳圖譜。大量篩選適用于觀賞園藝植物花品種的SSR 標記，將是深入開展觀賞園藝花品種指紋圖譜研究必須應對的重要挑戰。在與傳統育種技術相結合的基礎上，利用和開發更為高效的分子標記方法（例如EST-SSR 標記）成為觀賞園藝植物標記育種研究的重點之一。