一種飼料檢測氨基酸分析柱自行裝填方法

◆作者：覃美運楊曦＊羅琴劉成模陳小燕任秋香

◆單位：1.廣東恒興飼料實業股份有限公司;2.農業農村部華南水產與畜禽飼料重點實驗室

氨基酸分析儀在各領域都被人們高度重視。氨基酸分析是現代飼料工業和食品工業實施質量控制以及臨床醫學和生物化學研究領域必不可少的手段。1958年，Spackman、Moor和Stein合作研制出世界上第一臺用離子交換樹脂和柱后茚三酮衍生檢測的自動氨基酸分析儀，使用氨基酸定量分析進入一個嶄新階段。氨基酸分析儀的核心部件是離子交換柱。氨基酸分析儀主要靠它把具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離開來進行定量，所以說離子交換柱是氨基酸分析儀的心臟，可見離子交換柱中樹脂的重要性。因此，本文詳細介紹了英國百康30+全自動氨基酸分析儀的分析柱填料的清洗、活化、裝填及效果驗證等過程。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

全自動氨基酸分析儀：30+型，英國百康公司；離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

甲醇（分析純）、乙二胺四乙酸（EDTA）（分析純）、濃鹽酸（優級純）、緩沖液6（0.4mol/L氫氧化鈉溶液），緩沖液3（檸檬酸鈉19.6 g，濃鹽酸15.5 mL，苯酚1.2 g，異丙醇50 mL，加超純水定容至1 L并調節pH值為2.65的溶液），緩沖液4（檸檬酸鈉7.35 g，濃鹽酸1.5 mL，苯酚1.2 g，氯化鈉23.49 g，硼酸鈉4.77 g，L-羥脯氨酸0.00197 g，加超純水定容至1L并調節pH值為8.6）。實驗用水為超純水。

1.2 實驗過程

1.2.1 樹脂清洗試驗

取出樹脂，打開分析柱一頭，將未打開一頭接到儀器。將Biosys Manual軟件打開，勾上Override，然后將分析柱下端柱套打開，用緩沖液6將樹脂沖出，接入一個干凈燒杯中，直至柱中只流出透明緩沖液，代表樹脂已從分析柱中徹底沖出，然后將分析柱與儀器連接管路斷開。由于清洗過程中會有微量的柱填料損失，需要將色譜柱包裝盒中自帶同批號的柱填料補充到燒杯。

1.2.2 樹脂清洗過程

將甲醇溶液（200 mL超純水+100 mL甲醇）加入燒杯中，微沸后繼續小火加熱30 min，邊加熱邊不停攪拌。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，當混合液冷至室溫后，過濾或離心除去清洗液，用100 mL超純水重復清洗樹脂2-3次。再加入200 mL超純水、4 g EDTA和200 mL濃鹽酸，濃鹽酸加入時邊加邊攪拌。溶解后加熱，微沸后繼續小火加熱60 min，邊加熱邊不停攪拌（注：EDTA一共加4 g，與溶液體積無關）。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，混合后冷卻至室溫，過濾或離心除去清洗液，然后用100 mL超純水重復清洗樹脂3-5次。在樹脂中加入200 mL 6號Buffer，加熱，微沸后繼續小火加熱30 min，邊加熱邊不停攪拌。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，混勻后冷卻至室溫，過濾或離心除去清洗液，然后用100 mL超純水重復清洗樹脂2-3次。最后在樹脂中加入最小體積6號Buffer，轉移到樹脂瓶中儲存。

1.2.3 分析柱裝填過程

將延長柱與分析柱打開一頭連接，注意與分析柱連接一邊的延長柱中應放入白色密封圈防止漏液，上端管路接在分析柱用緩沖液6將分析柱身填滿，當延長柱有微量緩沖液流出時再往里加樹脂，目的是保證完全排出柱身中的空氣，延長柱一次性裝完樹脂避免出現填充密度不均勻的現象。

將樹脂混懸液倒入或者用滴管轉移進入延長柱，用緩沖液6補齊延長柱中空間（必須用緩沖液6填滿，否則會填入空氣），蓋上上蓋（此時注意提起上蓋的小柱子防止它把延長柱上端的液體排出導致進入空氣），并將上流端口的管路連接到延長柱上端擰緊（注意分析柱與延長的接口端是不一樣的，延長柱的接口端需要將管路拉長插入延長柱確保不漏氣，保持壓力穩定）。觀察幾分鐘未漏液就可以將兩端都接上儀器管路，放入柱溫箱，此時在Biosys Manual軟件界面設置線圈135℃，柱溫設置為50℃。在BiosysManual軟件界面選擇緩沖液6，調節流速使緩沖液壓力在85~90 bar左右（開始時壓力很小，可以加大流速，隨著壓力不斷增加可以逐漸減小流速），觀察壓力在2~3min內始終穩定，可以認定壓力穩定，當壓力穩定后確定流速，此時可以建立一個自動切換沖洗程序，復制一個再生程序按以下要求填寫：

用確定后的流速沖洗緩沖液6沖洗30 min，柱溫設置為50℃。用同樣流速緩沖液4沖洗1 h，柱溫設置為50℃。用同樣流速緩沖液3沖洗1 h，柱溫設置為50℃。此時壓力應該在120 bar左右。如果沒有到達，加大流速使之達到120 bar左右，再沖洗10 min（注意：此階段關注壓力，當壓力過大降低流速，控制壓力在120 bar左右），壓力過大會擠破分析柱另一頭的篩板）。打開分析柱與延長柱，這時分析柱的樹脂應該是平的。裝好分析柱，即可使用。將延長柱中樹脂沖出，重新裝入樹脂罐中，以便下次再用。延長柱用水洗，然后再用無水乙醇沖洗，晾干。注意：分析柱接頭部分是塑料材質，請不要使勁擰，以免破裂，可以在連好儀器后，在使用緩沖液沖時，如果有漏液，再稍微擰緊。

2 結果與討論

2.1 氨基酸分析柱要清洗活化的原因

氨基酸分析柱中的離子交換樹脂為什么要清洗？在什么情況下要清洗樹脂？長時間使用過程樣品中的雜質吸附在樹脂上會發生樹脂污染，一般來源于樣品前處理，通過嚴格的前處理是可以在一定程度上避免污染的發生，但當樹脂被污染時，會出現峰型不規則，分離度差，伴隨柱壓高，隨著時間延長分離度越來越差的現象。本試驗先選擇有機溶劑甲醇溶液清洗，目的是清洗掉吸附在樹脂上的疏水性物質，例如烷烴、油、脂肪等雜質。然后再加入乙二胺四乙酸和濃鹽酸，目的是清洗蛋白質及金屬污染物，最后加入6號buffer緩沖液清洗碳水化合物。

2.2 清洗、活化和裝填后的性能分析

全自動氨基酸分析儀的分析柱是采用惰性PEEK材料，填料可耐受高堿濃度再生試劑、高溫（99℃）再生程序，性能好，價格高。通過本文講述清洗樹脂的試驗及填裝分析柱的方法可以恢復分析柱性能（圖1）。通過和新購入色譜柱完成的色譜圖（圖2）對比各個峰的分離度和柱效幾乎和新購入分析柱一致，經過近4個月的使用，分離度和柱效無明顯下降。因此，清洗樹脂并自行裝填分析柱是恢復分析柱性能的一種非常有效的方法，清洗后可使用較長時間，較好節約檢測成本。

圖1 重新裝填后色譜柱樣品色譜圖

圖2 新購入色譜柱樣品色譜圖

2.3 樣品分析

通過清洗、活化和裝填后的氨基酸分析柱，完成對日常樣品的檢測，通過與新購入的氨基酸分析柱對比結果（表1），兩者之間無顯著差異。

表1 重新裝填分析柱和新購入分析柱對實際樣品檢測結果

3 結論

建立了一種對已使用較長時間且柱效較差氨基酸分析柱進行重新處理和裝填的方法，填充后的柱效和新購入分析柱無顯著差異。通過近4個月的使用，效果無明顯下降，是恢復分析柱性能的一種非常有效的方法，能大幅節約檢測成本。

參考文獻:(略)