京尼平鞏膜交聯對形覺剝奪性近視模型兔安全性的研究

許寅聰，陳 達，陳 靜，劉超敏，李 娟，王超英，張素華，趙亞芳

目前，全球近視人口數量不斷增長，近視發病率過快增長已引起社會高度關注。據統計，全世界高度近視患者約有1.63億[1-2]。61.7%的高度近視人群會出現嚴重并發癥，特別是當近視度數超過-10.00 D時，極易出現黃斑病變[3-4]，引起患者生活質量嚴重降低，帶來沉重的社會負擔，且臨床上缺乏控制近視的有效手段。受到紫外線A-核黃素角膜交聯技術在角膜疾病中應用的啟發[5-6]，國內外學者積極探索鞏膜膠原交聯方法并希望將其應用于病理性近視的治療中，目前鞏膜的交聯方法分為物理交聯和化學交聯兩種[7]。本實驗為探索化學交聯方法，采用后Tenon's囊下注射京尼平的方法，將藥物直接注射于后極部鞏膜，希望引起后極部鞏膜的交聯效應，增強鞏膜生物力學強度，達到延緩或抑制近視發展的目的。京尼平是一種天然交聯劑，提取自中藥梔子，是梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解后的產物，具有良好的生物相容性和低毒性，因此得到國內外學者的青睞[8-9]。近年國內外部分學者圍繞京尼平的交聯效應展開了一系列研究，證明了京尼平確實可以增強鞏膜的生物力學強度，但是對其安全性仍不甚明確[10-12]。故本研究通過觀察形覺剝奪性近視模型兔進行京尼平鞏膜交聯后視網膜的電生理以及視網膜、鞏膜纖維、視神經纖維、眼外肌纖維的形態變化，來評估京尼平鞏膜交聯的安全性。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 選擇14日齡健康幼兔(新西蘭大白兔)60只(購自河北醫科大學實驗動物中心)，雌雄不限，在解放軍聯勤保障部隊第九八〇醫院實驗動物中心由專人進行飼養。研究涉及實驗動物已經取得醫院動物實驗倫理委員會批準(批準編號2018-KY-09)。京尼平產地日本。新生牛血清和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶生物科技有限公司。RetiMINER-S型視覺電生理儀購自重慶艾爾曦醫療設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組及模型建立：60只幼兔飼養室溫20～23 ℃，光照與黑暗的周期比例為1∶1。采用隨機數字表法將60只幼兔分為空白對照組、近視模型組和京尼平注射+眼瞼縫合組3組，每組20只，均以右眼為實驗眼，左眼未處理。空白對照組雙眼均不處理，近視模型組實驗眼進行眼瞼縫合，京尼平注射+眼瞼縫合組實驗眼結膜下注射0.5 mmol/L京尼平0.25 ml，隔日1次，連續注射4次，每次注射后縫合眼瞼，注射前拆線進行下一次注射，第一次和第三次注射部位為鼻上1點鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下，第二次和第四次注射部位為顳下7點鐘方向角膜緣后3 mm Tenon's囊下。眼瞼縫合均采用雙“U”字形縫合，使用氧氟沙星眼膏涂眼每日1次，眼瞼縫合共持續60 d。

1.2.2閃光視網膜電圖(F-ERG)檢查：實驗60 d后使用復方托吡卡胺滴眼液充分雙眼散瞳，將幼兔置于絕對暗室進行暗適應20 min，后固定幼兔，使用氯胺酮注射液35 mg/kg肌內注射麻醉，使用0.5%丁卡因進行角膜表面麻醉，使用表面涂有氧氟沙星眼膏的角膜電極置于角膜表面(作用電極為鍍金角膜電極，記錄條件符合國際標準)，參考電極和接地極分別安置在幼兔額部正中和耳緣皮下，擺放幼兔頭位置伸入刺激球，使檢測眼正對刺激球閃光點。行雙眼F-ERG檢查，順序為實驗眼暗適應3.0檢查(無背景光，3.0 cd×s/m2，白色閃光，通頻帶1～300 Hz)，對照眼行暗適應3.0檢查。檢查期間對側眼始終用遮光眼罩完全遮蓋，所有測量均由同一名技術人員完成。

1.2.3病理形態學檢查：實驗60 d后，使用氯胺酮注射液(35 mg/kg)肌內注射麻醉，選擇空氣栓塞法處死幼兔，固定于手術臺上，在無菌條件下取出眼球，清除結膜及筋膜，保留眼外肌和視神經，將眼球標記清楚，依次放入眼球保存液1(25%新生牛血清，2% DMSO，2.5%蔗糖)、液2(25%新生牛血清，4% DMSO，5.5%蔗糖)、液3(25%新生牛血清，6% DMSO，7.5%蔗糖)，在每種保存液中浸泡10 min，最后置于眼球保存液4(25%新生牛血清，7.5% DMSO，10.0%蔗糖)中，密封好后放入-196 ℃液氮中保存。運輸至光鏡實驗室，將離體兔眼從液氮中取出后放入37 ℃水浴箱中復溫，然后使用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，于視神經顳側垂直鞏膜連續切片至外直肌，視神經使用垂直視神經軸位方向切片，厚度0.5 μm，進行HE染色，用光學顯微鏡逐層觀察視網膜、視神經、鞏膜、眼外肌，并照相記錄。

1.3觀察指標 對3組均進行F-ERG檢測，比較a波振幅、a波潛伏期、b波振幅、b波潛伏期。因考慮需評估京尼平的不良反應，僅對京尼平注射+眼瞼縫合組進行光學顯微鏡HE染色觀察眼部結構，包括鞏膜、眼外肌、視網膜、視神經結構，以及觀察視網膜細胞、鞏膜膠原纖維、視神經纖維、眼外肌纖維排列情況和是否存在炎性細胞浸潤。

2 結果

2.1F-ERG檢查結果 在實驗60 d后對3組幼兔進行F-ERG檢查，分析暗適應3.0檢查結果發現，3組的a波振幅、b波振幅、b波潛伏期比較差異有統計學意義(P<0.05)。但3組間a波潛伏期比較差異無統計學意義(P>0.05)。近視模型組a波振幅、b波振幅、b波潛伏期與空白對照組和京尼平注射+眼瞼縫合組比較均顯著降低(P<0.05)，但空白對照組與京尼平注射+眼瞼縫合組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組幼兔實驗眼閃光視網膜電圖檢查結果比較

2.2病理組織學觀察 對京尼平注射+眼瞼縫合組進行觀察，角膜、結膜及鞏膜大體觀察實驗眼與對照眼之間無明顯差別。見圖1。HE染色后，使用光學顯微鏡觀察實驗眼發現鞏膜、眼外肌、視網膜、視神經結構清晰，未發現異常變性壞死視網膜細胞，鞏膜膠原纖維、視神經纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見明顯炎性細胞浸潤。見圖2。

圖1 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔角膜、結膜及鞏膜大體觀察

圖2 京尼平注射+眼瞼縫合處理幼兔實驗眼視網膜、鞏膜纖維、神經纖維、眼外肌纖維病理組織學觀察(HE×200)

3 討論

病理性近視的發病機制與鞏膜的生物力學特點和自身的缺點有關，因為從眼球壁三層結構的力學性能來看，在相同應力的作用下，從視網膜、脈絡膜到鞏膜的切線模量呈逐步遞增的趨勢[13]，而鞏膜膠原纖維在后鞏膜葡萄腫形成過程中起到了至關重要的作用。目前臨床治療病理性近視方法匱乏，國內臨床應用相對廣泛的是后鞏膜加固術，手術對于高度近視黃斑裂孔、阻止眼球繼續增長具有一定效果[14]，但其長期有效性及安全性仍需觀察。目前，探索鞏膜膠原交聯方法并用于病理性近視的治療成為研究熱點，其中天然交聯劑京尼平因具有優良生物相容性和低毒性在眾多交聯劑中脫穎而出，本文圍繞京尼平鞏膜交聯的安全性進行研究。

本研究設計了3組，分別為空白對照組、近視模型組、京尼平注射+眼瞼縫合組，這樣分組的目的是為更全面觀察形覺剝奪性近視模型兔中京尼平鞏膜交聯的安全性。在視網膜電生理檢查指標中選擇F-ERG暗適應3.0檢查，這是因為目前臨床應用的各項檢查中只有暗適應3.0檢查可綜合反映視桿細胞和視錐細胞混合系統功能，其主要觀察指標是a、b波的潛伏期和振幅，a波反映視桿細胞和視錐細胞的功能，b波反映雙極細胞的功能。之所以選擇幼兔作為動物模型是因為出生14～74 d處于眼球的快速發育階段[15]，此階段有利于形覺剝奪性近視模型建立，同時也模擬了病理性近視眼軸延長的過程。

本文F-ERG暗適應3.0檢查結果顯示，近視模型組實驗眼的a波振幅、b波振幅較空白對照組出現了顯著的降低，說明在形覺剝奪60 d后幼兔發生了近視化，與此同時視網膜細胞功能出現下降。本研究還顯示，京尼平注射+眼瞼縫合組的a波振幅及潛伏期、b波振幅及潛伏期均無異常，這除了說明京尼平鞏膜交聯有良好安全性外，還證明其可通過控制鞏膜擴張起到保護剝奪性近視致視網膜功能損傷作用。

考慮到在實際注射京尼平后，藥物存在局部擴散使得京尼平鞏膜交聯不具備特異性，鞏膜周圍的眼外肌、視神經、血管等組織均存在被交聯的可能性，所以本研究又觀察了京尼平注射+眼瞼縫合組實驗眼的病理學形態改變，使用光學顯微鏡HE染色觀察發現，鞏膜、眼外肌、視網膜、視神經結構清晰，未發現異常變性壞死視網膜細胞，鞏膜膠原纖維、視神經纖維、眼外肌纖維均排列整齊，所有組織均未見明顯炎性細胞浸潤，這說明京尼平對于視網膜、鞏膜、視神經、眼外肌是安全的。但本研究僅選擇使用光學顯微鏡進行檢查，未能使用高倍電鏡觀察細胞內的微結構改變，今后需進行補充以使結果更具有說服力。

前期研究發現，對形覺剝奪性近視模型兔進行京尼平鞏膜交聯后的鞏膜條帶彈性模量、極限應力均出現顯著增強，極限應變、蠕變率出現降低，說明交聯后鞏膜不易發生變形擴張[16]。HOANG等[17]也通過熱力學實驗發現，京尼平交聯活體兔眼鞏膜后會提高其收縮溫度，闡明了后Tenon's囊下注射京尼平可以提高鞏膜的生物力學強度，有效阻止近視的發生發展。

總之，對形覺剝奪性近視模型兔眼后Tenon's囊下注射京尼平進行鞏膜膠原交聯能提高鞏膜生物力學強度，有效阻止動物模型近視眼發展；有良好安全性，不會損傷視網膜視細胞功能，對鞏膜、視網膜、視神經及眼外肌細胞不會構成形態學損傷。