不同乳酸菌添加劑對苦荬菜青貯品質的影響

張嘉懿， 格根圖*， 賈玉山， 王志軍， 張佳偉， 閆星全， 司 強， 趙牧其爾， 孫 林

(1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院， 農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室， 內蒙古 呼和浩特 010019； 2.內蒙古自治區農牧業科學院， 內蒙古 呼和浩特 010031)

苦荬菜(Lactucaindica)原產于亞洲，由野生的山萵苣馴化栽培而來[1]，是菊科萵苣屬一年生或二年生草本植物,因其具有產量高、適應性強、適口性好等特點，適宜在我國大部分地區種植[2]，是一種優質的青綠飼料作物。苦荬菜可以直接青飼利用，但是生產季節收獲的苦荬菜堆積存放時容易發霉變質導致品質變差，無法在非生長季節為畜禽提供優質苦荬菜[3]。

青貯是保留牧草營養成分、延長牧草保存時間、解決牧草生產季節不均衡的一種方法[4]。苦荬菜由于含水量高，可溶性碳水化合物含量較低，直接青貯很難獲得優質青貯飼料[5]。有研究發現，加入添加劑可以改善畜禽飼料的青貯品質[6]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)是青貯調制中較為常用的兩種乳酸菌添加劑。植物乳桿菌屬于同型發酵乳酸菌，在青貯發酵時能產生大量的乳酸，迅速降低pH值，提高發酵品質。謝曉華等[7]研究表明，添加植物乳桿菌使青貯小麥(Hordeumvulgare)的乳酸菌數量增加，同時pH值和氨氮濃度下降。Parvin等[8]研究表明，在多花黑麥草(Loliummultiflorum)中添加植物乳桿菌能顯著提高發酵品質，但是也顯著降低了乳酸菌數量。布氏乳桿菌屬于異型發酵乳酸菌，可將青貯飼料中的營養物質和乳酸分解為乙酸、丙二醇等，使得酵母菌、霉菌等有害微生物的生長被有效抑制。王磊等[9]研究表明，布氏乳桿菌可以降低高濕玉米(Zeamays)青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，改善青貯發酵品質。Gandra等[10]研究表明，在向日葵(Helianthusannuus)中添加布氏乳桿菌可以降低干物質含量，增加乳酸菌數量，同時抑制酵母菌和霉菌的活動。

目前植物乳桿菌和布氏乳桿菌多用于苜蓿、玉米、燕麥等植物的青貯中，而對苦荬菜青貯的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在探究植物乳桿菌和布氏乳桿菌對苦荬菜青貯品質的影響，篩選出適合苦荬菜青貯添加的乳酸菌，為苦荬菜用作青貯飼料的生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青貯原料為內蒙古農業大學自主培育的苦荬菜品種—‘蒙早’苦荬菜(Lactucaindica‘Mengzao’)，2021年5月8日在內蒙古農業大學溫室牧草試驗地播種，于2021年8月17日盛花期人工刈割，留茬高度3 cm，利用鍘刀切短至1～2 cm，自然狀態下陰干約10 h，待含水量降至60%～65%進行青貯調制。添加劑：植物乳桿菌和布氏乳桿菌均購自山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 試驗設計

試驗設置4個處理：即對照(CK組，無添加劑)、單獨添加植物乳桿菌(LP組，0.01 g·kg-1)、單獨添加布氏乳桿菌(LB組，0.01 g·kg-1)和混合添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌(LP+LB組，0.01 g·kg-1+0.01 g·kg-1)，添加量均為鮮重基礎，活菌數1.0×1010cfu·g-1，將添加劑溶于30 mL蒸餾水中，用噴壺噴灑在切短的原料上，對照組噴灑等量蒸餾水，每個處理3次重復，后裝入做好標記的聚乙烯袋中，每袋200 g抽真空密封，室溫條件下避光、干燥保存。青貯60 d后開袋測定其相關指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1營養成分 青貯60天后開袋將青貯樣品稱鮮重后，置于恒溫鼓風干燥箱內105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，稱干重。將烘干的樣品過不同目篩粉碎，混合均勻裝自封袋，用于測定營養成分。

干物質(Dry matter，DM)含量采用烘干法進行測定[11]；粗灰分(Crude ash，Ash)含量采用550℃灼燒法進行測定[11]；粗蛋白質(Crude protein，CP)含量使用全自動杜馬斯定氮儀進行測定[12]；酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量使用ANKOM A2000i型全自動纖維儀進行測定[13]；粗脂肪(Ether extract，EE)含量采用索氏提取法進行測定[11]；可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)采用蒽酮-硫酸比色法進行測定[14]。

1.3.2發酵品質 青貯60天后開袋將青貯樣品充分混合均勻，稱取10 g青貯樣品置于聚乙烯拍打袋中，并加入90 mL無菌水，用勻質儀拍打2 min后過濾，所得濾液分成兩份，分別用于測定發酵品質和微生物數量。使用pH計測定濾液的pH值；有機酸含量使用高效液相色譜儀(HPLC)測定，利用0.22 μm的水系濾膜對濾液進行過濾后注入進樣小瓶中，上機測定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)、丁酸(Butyric acid，BA)含量；氨態氮(Ammonia-nitrogen，NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定[15]。

1.3.3微生物數量 將另一份濾液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋至10-1，10-3，10-5，采用平板計數法[16]測定青貯飼料中乳酸菌(Lactic acid bacteria)、一般好氧性細菌(Aerobic bacteria)、大腸桿菌(Coliform bacteria)、酵母菌(Yeasts)和霉菌(Molds)數量。乳酸菌使用乳酸菌固體(De Man，Rogosa，Sharpe，MRS)培養基30℃厭氧培養48 h后計數；一般好氧性細菌使用營養瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養基30℃培養48 h后計數；大腸桿菌使用大腸桿菌/大腸菌群液體顯色(Blue light broth，BLB)培養基30℃培養48 h后計數；酵母菌和霉菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養基30℃培養48 h后計數，所得數據用lg cfu·g-1of FM表示。

1.4 數據處理

利用Microsoft excel 2010處理數據，采用SAS 9.2對數據進行單因素方差分析，最終結果用“平均值±標準差”表示。同時利用模糊數學隸屬函數法[17-18]對不同處理的青貯品質進行綜合評價，首先分別計算各指標的隸屬函數值，然后按照不同指標隸屬函數值的平均值進行排名。

如果某個指標與青貯品質正相關，計算公式如下：

U(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

如果某個指標與青貯品質負相關，則用反隸屬函數進行計算，計算公式如下：

U(X)=1―(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：U(X)為隸屬函數值，X為某一指標的測定值，Xmax和Xmin為所有處理中某一指標的最大值和最小值。

2 結果與分析

2.1 苦荬菜青貯原料的營養成分及微生物數量

由表1可知，‘蒙早’苦荬菜原料的DM含量為27.28%，Ash含量為9.32%，CP含量為10.08%，NDF含量為57.40%，ADF含量為49.31%，EE含量為3.80%，WSC含量為2.02%。原料里一般好氧性細菌的數量最多，為6.45 lg cfu·g-1FM，酵母菌數量和大腸桿菌數量次之，分別為4.55 lg cfu·g-1FM和4.09 lg cfu·g-1FM，數量最少的是乳酸菌，為3.84 lg cfu·g-1FM，同時檢測出霉菌，為3.00 lg cfu·g-1FM。

表1 苦荬菜青貯原料的營養成分及微生物數量Table 1 Nutritional components and fermentation quality of Lactuca indica silage raw materials

2.2 乳酸菌添加劑對青貯飼料營養成分的影響

由表2可知，青貯60 d后，LB組的DM含量顯著低于CK組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異；添加劑組的CP含量均顯著低于CK組(P<0.05)；CK組的WSC含量顯著高于LB組和LP+LB組(P<0.05)；各處理組之間的Ash，NDF，ADF和EE含量均無顯著差異。

表2 乳酸菌添加劑對青貯飼料營養成分的影響Table 2 Effect of lactic acid bacteria additives on nutritional components of silage

2.3 乳酸菌添加劑對青貯飼料發酵品質的影響

由表3可知，添加劑組的pH值均顯著低于CK組(P<0.05)，其中LP組的pH最低，為4.67；LP組和LP+LB組的LA含量顯著高于其他組(P<0.05)，且LP組的LA含量高于LP+LB組，但差異不顯著；LB組的AA含量顯著高于其他處理組(P<0.05)；各添加劑組的NH3-N/TN均顯著高于CK組(P<0.05)；各處理組中均未檢測出丙酸和丁酸。

表3 乳酸菌添加劑對青貯飼料發酵品質的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria additives on fermentation quality of silage

2.4 乳酸菌添加劑對青貯飼料微生物數量的影響

由表4可知，各添加劑組的乳酸菌數量均顯著高于CK組(P<0.05)，其中LP組的乳酸菌數量最多，為7.71 lg cfu·g-1FM；各處理組的一般好氧性細菌數量無顯著差異；LB組的酵母菌數量顯著低于CK組(P<0.05)；各處理組中均未檢測出大腸桿菌和霉菌。

表4 乳酸菌添加劑對青貯飼料微生物數量的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria additives on microbial quality of silage

2.5 青貯飼料品質的隸屬函數綜合評價

本試驗采用隸屬函數法，以CP，WSC，乳酸菌，LA，AA，NDF，ADF，pH值，NH3-N/TN，酵母菌10個指標，對苦荬菜4個處理的青貯品質進行多指標綜合評價。隸屬函數平均值越高表明該處理的青貯品質越好，結果如表5所示，青貯品質最好的是LP組，其次是LP+LB組和CK組，最差的是LB組。

表5 乳酸菌添加劑對青貯飼料品質影響的綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of the effect of lactic acid bacteria additives on silage quality

3 討論

3.1 乳酸菌添加劑對苦荬菜青貯飼料營養成分的影響

營養成分是反映飼料品質的重要指標，通過營養成分可以直觀地評價飼料品質的優劣[9]。唐振華等[19]研究發現在甘蔗尾青貯中添加20 mL布氏乳桿菌菌液顯著降低了DM含量。Reich等[20]研究認為添加布氏乳桿菌會造成青貯飼料干物質含量的損失。本試驗中，LB組的DM含量顯著低于CK組，這與上述研究結果一致，這可能是因為在青貯過程中，布氏乳桿菌將乳酸分解為乙酸、1，2-丙二醇、乙醇和CO2時需要降解可溶性碳水化合物提供能量，而可溶性碳水化合物的降解會降低DM含量[21]。各添加劑組的CP含量均顯著低于CK組，可能由于添加劑的加入使青貯飼料中的植物蛋白酶和附著的微生物共同反應，導致CP被降解成多肽、游離氨基酸和氨，CP含量減少[22]。WSC是青貯發酵中微生物產生乳酸等有機酸的底物。相比CK組，添加劑組的WSC含量均下降，這與Contreras-Govea等[23]研究結果不一致，主要是因為添加劑組的乳酸菌數量多于CK組，使得乳酸菌發酵需要消耗更多的WSC，所以剩余較少的WSC。其中LB組的WSC含量最低，原因可能是布氏乳桿菌在青貯發酵過程中除了產生乳酸外，還需要消耗WSC去產生乙酸。

3.2 乳酸菌添加劑對苦荬菜青貯飼料發酵品質的影響

青貯發酵過程中，pH值，LA，AA，PA和BA含量是評價發酵品質的重要指標。在本試驗中，與CK組相比，各添加劑組的pH值均顯著降低，這與侯健健等[24]的研究結果相似，說明添加乳酸菌能有效地降低苦荬菜青貯飼料的pH值。其中LB組的pH值略高，可能是因為布氏乳桿菌將青貯過程中所產生的部分LA分解并轉化為AA，劉輝等[25]也得到了相同的研究結果。本試驗中，LP組的LA含量顯著高于除LP+LB組以外的其他兩組，而LB組的AA含量顯著高于其他處理組，這與Winters等[26]的研究結果一致，植物乳桿菌是同型發酵乳酸菌，在發酵過程中能產生大量LA，而布氏乳桿菌是異型發酵乳酸菌，在厭氧條件下將部分LA直接分解轉化為AA。而LP+LB組LA含量低于LP組但高于LB組，AA含量高于LP組但低于LB組，說明混合添加不同發酵類型的乳酸菌可以提高苦荬菜青貯飼料的LA和AA含量，這與司華哲等[27]研究結果一致。NH3-N/TN可以反映青貯飼料中蛋白質和氨基酸的降解情況，本試驗中，各添加劑組的NH3-N/TN均顯著高于CK組，說明加入添加劑后苦荬菜青貯飼料中的蛋白質經蛋白酶分解后參與體內代謝活動產生了NH3-N[28]。各處理組中均未檢測出BA，原因可能是添加劑的加入增加了青貯飼料中乳酸菌的數量，抑制有害微生物的不良發酵，降低了BA的含量。

3.3 乳酸菌添加劑對苦荬菜青貯飼料微生物數量的影響

青貯發酵是一個復雜的微生物發酵過程，原料特性、發酵環境及原料附生微生物等因素決定了青貯能否成功[29-30]。有研究表明原料附著的乳酸菌數量大于105cfu·g-1FM時，青貯更容易成功[31]。‘蒙早’苦荬菜附著的乳酸菌數量較少，所以需要額外添加乳酸菌來促進青貯發酵，本試驗發現由于不同乳酸菌添加劑的加入，各添加劑組的乳酸菌數量均較CK組顯著增加。在青貯飼料發酵過程中，酵母菌的存在往往是不利的，一般會引起飼料青貯品質的腐敗變質[32-33]。本試驗中添加劑組的酵母菌數量均有所下降，其中LB組的酵母菌數量最少，這可能是因為布氏乳桿菌發酵產生大量乙酸，而乙酸可以有效抑制酵母菌等有害細菌的活動。各處理組中均未檢測出大腸桿菌和霉菌，這可能是因為苦荬菜青貯飼料中乳酸菌數量增加，促進青貯發酵快速產生乳酸，pH值下降，抑制了有害微生物大腸桿菌和霉菌的繁殖。

3.4 苦荬菜青貯飼料品質的隸屬函數綜合評價

青貯飼料的品質是由多個指標共同影響的，不能根據單一指標對其評價。隸屬函數法可以在多個指標的基礎上對青貯品質進行更全面、可靠的綜合評價[34]。本試驗采用隸屬函數法綜合評價苦荬菜4個處理的青貯品質，排名由高到低依次為LP組>LP+LB組>CK組>LB組。LB組的排名在CK組后面，原因可能是LB組的CP和WSC含量在青貯發酵過程中消耗得較多，但其他測定指標相比于CK組得到了改善[35]。

4 結論

本試驗表明，在苦荬菜青貯時單獨或混合添加不同發酵類型乳酸菌均能增加乳酸和乙酸含量，降低pH值，從而改善苦荬菜青貯飼料的發酵品質；采用隸屬函數法綜合評價，得出LP組的青貯品質最好，說明在調制苦荬菜青貯飼料時添加植物乳桿菌能提高青貯效果。