化學添加劑對有氧脅迫下濕貯玉米發酵品質和有氧穩定性的影響

劉宇洋, 高文韓, 孔令芝, 鄭楊晨, 劉 暢, 何 濤, 薛艷林, 李井春, 李雁冰*

(1. 黑龍江八一農墾大學動物科技學院， 黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室， 黑龍江 大慶 163319；2. 內蒙古自治區農牧科學院， 內蒙古 呼和浩特 010031； 3.農業農村部東北平原農業綠色低碳重點實驗室， 黑龍江 大慶 163319)

濕貯玉米又稱高水分玉米，是指將水分含量在28%～35%或以上破碎后進行貯藏和發酵的玉米籽粒[1]。與干玉米相比，由于濕貯過程中淀粉顆粒的疏水基被微生物分解，濕貯玉米具有在瘤胃中更容易被消化的優點，進而成為一種廣泛使用的反芻動物飼料[2]。濕貯玉米可減少玉米收獲時的烘干成本，在發生暴雨、洪澇等自然災害后，直接將受災玉米收獲進行濕貯，也可減少損失[3-4]，因此，制作濕貯玉米這一方式值得使用與推廣。

Canizares等[5]使用不同比例的濕貯玉米代替干玉米飼喂阿爾卑斯山羊，發現在日糧中使用濕貯玉米對產奶量沒有任何影響，可以完全替代干玉米；Archibeque等[6]研究結果表明，使用濕貯玉米代替干玉米飼喂肉牛，可以明顯減少牛糞中的淀粉和臭味化合物，對肉牛的生產性能的影響卻不大；Salvo等[7]研究表明，在濕貯玉米中使用外源纖維酶可以提高肉牛的生產性能；Kung等[8]研究表明，使用丙酸和微生物混合接種時，可以改善濕貯玉米發酵品質和有氧穩定性。

在青貯過程中，空氣的滲入對青貯飼料有很大的影響。Pitt等[9]認為，由于空氣的滲入會造成每個月損失1%～3%的干物質；Woolford等[10]研究表明在青貯過程中空氣的滲入可以引起青貯飼料的變質。Gerlach等[11]研究表明如果將變質的青貯飼料飼喂動物可以引起動物的生產性能下降甚至危害動物的生命，導致經濟損失。然而Borreani等[12]研究指出在生產過程中很難阻止空氣滲入到青貯飼料中,該現象主要有3種原因：一是由于青貯的低填充密度或者由于青貯原料自身的原因造成青貯窖中含有過多的氧氣[13]；二是在飼喂階段，青貯窖被打開，由于不能一次性的使用完整個青貯窖的青貯飼料，所以青貯飼料不可避免的與氧氣發生接觸[14]；三是由于青貯窖密封材料自身的透氣性，造成青貯過程中氧氣的不斷滲入[15]。一種山梨酸鉀、苯甲酸鈉和亞硝酸鈉組成的化學添加劑可以在青貯過程中有氧脅迫的條件下來改善青貯的發酵品質和提高有氧穩定性[16-17]。在濕貯玉米中也有相關研究Da Silva等[18]發現化學添加劑可以在相對較短的濕貯時間改善濕貯玉米的發酵品質和有氧穩定性。因此，本研究為探究苯甲酸鈉、山梨酸鉀和亞硝酸鈉組成的化學添加劑能否消除濕貯期間氧氣帶來的負面影響，采用2種水分含量(35%，50%)，模擬3種濕貯期間有氧脅迫(前期有氧脅迫1～7 d，后期有氧脅迫22～28 d，全程有氧脅迫1～28 d)分別添加不同劑量(無添加，2 mL·kg-1，4 mL·kg-1)。

1 材料與方法

1.1 濕貯玉米的調制與化學添加劑的制備

試驗所用玉米種植于大慶市龍鳳區保田村，品種為‘鄭單958’完熟期收獲，收獲后立即破碎。根據原料含水量，將滅菌蒸餾水均勻的噴灑在破碎的玉米上，使含水量分別為35%和50%，并將化學添加劑均勻的噴灑在玉米上。添加劑量分別為無添加(對照組)，2 mL·kg-1(添加組1)，4 mL·kg-1(添加組2)。使用容量為500 mL的白色聚乙烯罐進行濕貯。裝填密度為，35%含水量濕貯玉米(DM) 715 kg·m-3，50%含水量濕貯玉米(DM)550 kg·m-3。濕貯時間為28 d，3個重復。苯甲酸鈉、山梨酸鉀、亞硝酸鈉(分析純級，均購自天津科密歐化學試劑有限公司)，按照固定比例4∶2∶1與滅菌蒸餾水混合并充分攪拌。

1.2 有氧脅迫處理

濕貯期間的有氧脅迫處理方法參照Kung等[19]處理的方法。在聚乙烯罐的蓋子上鉆一個直徑為6 mm的孔，在聚乙烯罐兩面分別鉆一個直徑為6 mm的孔，使兩個孔之間呈180度，兩孔之間的連線垂直于蓋子上的孔。在非有氧脅迫期間使用內徑為6 mm，外徑為8 mm的丁基橡膠塞塞住，周圍則使用中性硅酮耐候膠密封，在有氧脅迫期間則打開塞子，結束后使用中性硅酮耐候膠重新密封。在青貯罐的蓋子上還連接有一個橡膠軟管，軟管另一端連接在裝水的燒杯中，用于排除濕貯前期的氣體，在軟管上還有一個夾子，在第7 d后夾上夾子，避免空氣進入。前期有氧脅迫處理(Early air stress，EAS)為濕貯的1～7 d，每天打開橡膠塞2 h，后期有氧脅迫處理(Later air stress，LAS)為22～28 d，每天打開橡膠塞2 h，全程有氧脅迫(Full air stress，FAS)為1～28 d，每天打開橡膠塞2 h。

1.3 測定指標及方法

將開封后和有氧暴露7 d后的濕貯玉米放置在65℃電熱鼓風干燥箱(DGG-9240B，上海森信實驗儀器有限公司)中48 h后取出，稱量差值得出干物質含量。取開封后和有氧暴露7 d后的濕貯玉米樣本20 g分別與180 mL滅菌生理鹽水(0.85%)混合，并逐層稀釋，進行微生物數量的檢測。參考李金庫等[20]文中的方法測定乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌數量(MRS培養基、VRBA培養基、PDA培養基購自青島海博生物技術有限公司),使用電熱恒溫培養箱(DRP-9272，上海森信實驗儀器有限公司)37℃培養48 h。取開封后和有氧暴露7天后的濕貯玉米，稱取 20 g，加入180 mL的蒸餾水，混合均勻后用精密pH計(PSH-3C，上海虹益儀器儀表有限公司)測定pH并保留適量混合溶液。將保留的混合溶液，使用中速定性濾紙(102，杭州富陽北木漿有限公司)過濾過后，使用高效液相色譜法測定有機酸的含量。色譜條件為：高效液相色譜儀(SHI-MADZE-10A)，色譜柱為：Shodex Rspak KC 811 S -DVB gel Column 30 mm×8 mm，檢測器：(SPD-M10AVP，流動相：3 mmol·L-1高氯酸，流速：1 mL·min-1；柱溫 50℃，檢測波長 210 nm，進樣量5 μL)。

1.4 有氧穩定性的檢測

將濕貯玉米樣品放入1 L的聚乙烯罐中，罐口完全敞開，使用雙層醫用無菌紗布覆蓋防止干燥和污染。將熱電偶溫度探頭放置在樣品的幾何中心，使用溫度記錄儀(THTZ3208R，余姚市騰輝溫控儀表廠)連續7 d每2 h測量一次室溫和每個樣品的溫度。有氧穩定性被定義為樣品溫度比環境溫度高2℃所用的時間[21]。

1.5 數據統計

使用Excel 2019 進行初步處理。采用SPSS 23 統計軟件對數據進行單因素ANOVA分析，采用Duncan氏法進行多重比較，結果以“平均值”表示；均以(P<0.05)為差異顯著性判斷標準。采用SPSS 23 統計軟件中一般線性模型單變量方差分析實現交互效應的方差分析，均以(P<0.05)為具有交互效應判斷標準；以(P<0.01)為具有極顯著交互效應判斷標準。開封檢測結果與有氧暴露7 d后檢測結果，采用SPSS 23統計軟件中成對樣本T檢驗進行比較，求得雙尾顯著性，以“*”代表在(P<0.05)的水平上顯著；“**”代表在(P<0.01)的水平上顯著；“NS”代表(P>0.05)無顯著性。

2 結果

2.1 破碎后玉米籽粒的特性

玉米籽粒的含水量為30.45%，水溶性碳水化合物為3.11%DM，pH值為5.98，乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌的數量分別為6.42，5.33，3.73 lg cfu·g-1。

2.2 不同時期有氧脅迫下化學添加劑對濕貯玉米發酵品質的影響

不同添加劑量的化學添加劑和不同有氧脅迫處理對35%含水量濕貯玉米的干物質、pH、乳酸、乳酸菌和酵母菌均有顯著影響，兩者的交互作用對乳酸菌和酵母菌的數量有極顯著影響，不同有氧脅迫處理對乙酸含量有顯著影響(表1)。不同添加劑量處理中對照組的干物質含量顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的干物質顯著低于EAS處理。不同添加劑量處理中對照組的pH顯著高于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的pH顯著高于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的乳酸含量顯著低于添加劑組，不同有氧脅迫處理中FAS處理的乳酸顯著低于EAS處理。不同添加劑量處理對乙酸濃度無影響，在不同有氧脅迫處理中FAS和LAS處理對照組的乙酸顯著低于EAS處理。不同添加劑量處理中對照組的乳酸菌數量顯著低于添加組2，在不同有氧脅迫處理中，FAS處理的乳酸菌數量顯著低于EAS處理。不同添加劑量處理中對照組的酵母菌數量顯著高于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的酵母菌數量顯著高于EAS和LAS處理。大腸桿菌在不同有氧脅迫處理和不同添加劑劑量處理中均未檢測出，故使用“<2”表示。

表1 不同時期有氧脅迫下35%含水量濕貯玉米發酵品質Table 1 Fermentation quality of wet storage maize at 35% moisture content under different periods of aerobic stress

不同劑量化學添加劑和不同有氧脅迫處理對50%含水量濕貯玉米的干物質、pH、乳酸、乳酸菌和酵母菌均有顯著影響，兩者的交互作用對干物質、pH和酵母菌有顯著影響，不同劑量化學添加劑和不同有氧脅迫處理以及兩者交互作用對乙酸無顯著影響(表2)。不同添加劑量處理中對照組的干物質顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的干物質顯著低于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的pH顯著高于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理顯著高于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的乳酸含量顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的乳酸含量顯著低于EAS和LAS處理。不同有氧脅迫處理和不同添加劑劑量處理對乙酸含量無影響。不同添加劑量處理中對照組的乳酸菌數量顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的乳酸菌數量顯著低于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的酵母菌數量顯著高于添加組1和添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的酵母菌數量顯著高于EAS和LAS處理。大腸桿菌在不同有氧脅迫處理和不同添加劑劑量處理中均為檢測出，故使用“<2”表示。

表2 不同時期有氧脅迫下50%含水量濕貯玉米發酵品質Table 2 Fermentation quality of wet storage maize at 50% moisture content under different periods of aerobic stress

續表2

2.3 不同時期有氧脅迫下化學添加劑對濕貯玉米有氧穩定性的影響

表3可知，化學添加劑在兩種含水量及不同有氧脅迫處理中均可以延長濕貯玉米的有氧穩定時間。添加組2除在35%含水量FAS處理外，其余處理中均達到168 h以上。

表3 2種含水量濕貯玉米的有氧穩定時間Table 3 Aerobic stabilization time of wet stored maize at 2 moisture contents

表4可知，不同有氧脅迫處理和不同化學添加劑劑量對有氧穩定性試驗后35%含水量濕貯玉米的干物質、pH、乳酸菌和酵母菌有極顯著影響，兩者的交互作用對乳酸菌數量有極顯著影響，不同化學添加劑劑量極顯著影響了乳酸、乙酸和大腸桿菌數量。不同有氧脅迫處理的添加組2開封檢測和有氧穩定性試驗后的檢測結果間的T-test檢驗均不顯著。不同添加劑量處理中對照組的干物質顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的干物質顯著低于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的pH顯著高于添加組1和添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的pH顯著高于EAS處理。在對照組中均未檢測到乳酸和乙酸，在添加組中能夠檢測到乳酸和乙酸，且添加組1和添加組2間乳酸具有差異顯著性，不同有氧脅迫處理間乳酸和乙酸不具有差異顯著性。不同添加劑量處理中對照組的乳酸菌數量顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的乳酸菌數量顯著低于EAS和LAS處理。不同添加劑量處理中對照組的酵母菌數量顯著高于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的酵母菌數量顯著高于EAS處理。在不同添加劑劑量處理中，只有對照組檢測出大腸桿菌，添加組1和添加組2中均未檢測出。

表4 35%含水量濕貯玉米7 d有氧穩定試驗后的發酵品質Table 4 Fermentation quality of wet stored maize at 35% moisture content after 7 d aerobic stabilization test

表5可知，不同有氧脅迫處理和不同化學添加劑劑量對有氧穩定性試驗后50%含水量濕貯玉米的干物質、pH、乳酸、乙酸、乳酸菌、酵母菌和大腸桿菌數量有顯著影響，兩者交互作用對pH、乳酸、乙酸、酵母菌和大腸桿菌有顯著影響。不同有氧脅迫處理的添加組2開封檢測和有氧穩定性試驗后的檢測結果間的T-test檢驗均不顯著。不同添加劑量處理中對照組的干物質顯著低于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理的干物質顯著低于EAS處理。不同添加劑量處理中對照組的pH顯著高于添加組1和添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理顯著高于EAS和LAS處理。在照組中均未檢測出乳酸和乙酸，在添加組1和添加組2中均檢測到乳酸和乙酸，且添加組1和添加2具有差異顯著性，EAS處理和FAS處理相比，能夠提高不同添加劑劑量的乳酸和乙酸含量。不同添加劑量處理中對照組的酵母菌數量顯著高于添加組2，不同有氧脅迫處理中FAS處理中酵母菌數量顯著高于EAS處理。在不同有氧脅迫處理中，添加組2均未檢測出大腸桿菌，EAS處理和FAS處理相比，能夠顯著減少大腸桿菌的數量。

表5 50%含水量濕貯玉米7 d有氧穩定試驗后的發酵品質Table 5 Fermentation quality of wet stored maize at 50% moisture content after 7 d aerobic stabilization test

3 討論

3.1 不同時期有氧脅迫處理對濕貯玉米發酵品質和有氧穩定性的影響

良好的厭氧環境不僅有利于乳酸菌的生長，還能抑制酵母菌等好氧細菌的生長，進而減少濕貯過程中干物質損失[22]。本研究發現3種有氧脅迫處理中，對濕貯玉米發酵品質和有氧穩定性負面影響最大的是全程有氧脅迫處理，這與Kim等[23]的研究結果相似。原因可能是在整個濕貯期都有氧氣的介入，不利于厭氧細菌的生長，使得好氧細菌和厭氧細菌長期存在競爭；也有可能是全程有氧脅迫處理使濕貯玉米中的氧氣并沒有被耗盡，原料中附著的好氧細菌活動仍然活躍，濕貯玉米始終處于或較長時間處于青貯微生物變化過程中的第一階段，即有氧階段[24]。3種有氧脅迫處理中，對濕貯玉米發酵品質和有氧穩定性負面影響最小是前期有氧脅迫處理。前期有氧脅迫處理與后期有氧脅迫處理和全程有氧脅迫處理相比負面影響最小原因可能是濕貯期間只有前期有氧氣的介入，厭氧環境比較良好，乳酸菌可以在前期有氧脅迫處理后迅速增殖并占據主導地位，產生和積累乳酸和乙酸[25]。另一種原因可能是，在前期有氧脅迫處理后氧氣不在再入濕貯玉米中，使得原料附著的好氧細菌被抑制，濕貯玉米能夠順利的進入青貯微生物變化過程中的第二階段，即厭氧發酵階段[26]。

3.2 不同劑量化學添加劑對有氧脅迫下濕貯玉米的發酵品質和有氧穩定性的影響

與對照組相比，4 mL·kg-1化學添加劑可以減少濕貯期間有氧脅迫帶來的負面影響。在Naiara等[27]研究表明，添加組的干物質和乳酸菌都高于對照組，Teller等[28]研究表明添加組的乙酸含量與對照組差異不顯著，這與本研究的結果相似。Silva等[18]研究表明添加組的酵母菌與對照組差異不顯著，這和本研究的結果不同，造成這樣的現象很可能是由于有氧脅迫處理所導致的。具體的說，這種化學添加劑不會對瓊脂平板酵母菌計數的結果帶來影響，但是會改變酵母菌組成的種類[18]，在本研究中有氧脅迫的處理可能造成了化學添加劑改變酵母菌種類的能力變弱，同時有氧脅迫處理又刺激了酵母菌的生長，因此，造成本研究中化學添加劑對酵母菌的顯著影響。盡管青貯期間的有氧脅迫處理會使青貯飼料的有氧穩定性變差，除35%含水量FAS處理組外所有的添加組2有氧穩定時間都在168 h以上，這與kung等[14]的研究結果相似。化學添加劑延長濕貯玉米的有氧穩定性，原因可能是對好氧細菌代謝的抑制作用。Morassi等[29]研究中證實了苯甲酸對細胞壁代謝相關酶有抑制的作用，Ostergaard等[30]研究中證實山梨酸可以抑制酵母菌細胞膜的代謝，陳瑤等[31]研究也證實了亞硝酸鹽可以阻斷好氧細胞的氧傳輸和氧化磷酸化。在本研究證實了化學添加劑能夠抑制酵母菌和大腸桿菌，雖然在開封檢測中對照組未檢測到大腸桿菌，但在有氧穩定性檢測中可明顯發現化學添加劑對大腸桿菌的抑制作用。

4 結論

苯甲酸鈉、山梨酸鉀和亞硝酸鹽組成的化學添加劑的添加劑量為4 mL·kg-1時，能夠明顯消除有氧脅迫帶來負面影響，可以顯著減少干物質的損失、顯著降低pH、顯著促進乳酸菌生長和乳酸的積累以及提高有氧穩定性。