藥品無菌檢查中污染微生物的鑒定

陳靜，夏培培(江蘇九旭藥業有限公司，江蘇 徐州 221000)

0 引言

若想確保無菌制劑藥品使用安全，其中做好藥品無菌檢查工作非常必要。這有利于保持現下無菌制劑藥品質量水平，降低臨床用藥階段誘發不良反應概率。微生物在使用的藥品中存活，不僅威脅用藥者生命安全，也會導致藥品生產企業面臨巨額經濟損失風險。為了更好地保證藥品質量，必須重視與加強藥品無菌檢查，做好微生物污染鑒定，確定污染源，為藥品質量安全管理工作高質量開展提供基礎保障。

1 藥品無菌檢查中污染微生物鑒定必要性分析

無菌制劑用藥安全與前期藥品無菌檢查工作質量有著十分密切關聯性，同時也直接影響著無菌制劑質量評控水平以及臨床不良反應情況的出現概率。通過對近些年來藥品無菌檢查實際情況的調研與分析，發現無菌藥害事件發生頻率逐漸提升。但由于藥品質量安全監管各項工作精準落實，使得無菌藥害事件所造成的負面影響并沒有擴大，這其中藥品無菌檢查在此過程中發揮了關鍵性作用。無菌藥品污染主要來自三個方面，分別是物理性污染、化學性污染以及微生物污染。其中導致微生物污染問題出現的成因較多，微生物污染是指在各種因素綜合作用影響下，使得無菌藥品中微生物含量超過國家規定標準，繼而發生微生物污染情況。微生物具有體積小、生長繁殖快、種類多以及適應強等特征，這在一定程度上加大了藥品無菌檢查難度，同時對此方面工作提出嚴格要求。目前國家現行《藥品生產質量管理規范》相關條例對藥品中微生物限量有著明確規定，要求通過開展藥品無菌檢查工作，對微生物限量進行監管，盡可能消除對無菌制劑對用藥者生命安全的威脅。

從現階段我國臨床用藥情況來看，用藥頻率逐年呈上升趨勢，在一定程度上加大了藥品質量安全監管難度。為了充分發揮藥品無菌檢查功能作用，必須做好污染微生物鑒定工作并確認藥品無菌檢查過程中是否會對藥品帶來污染影響。以明確微生物污染源，為進一步優化與完善優化藥品無菌檢查提供有價值參考依據。

2 污染微生物鑒定實驗

2.1 實驗準備

污染微生物鑒定的實驗準備流程如下：(1)實驗研究對象：革蘭式陽性球菌，數量為7株；(2)實驗要求：分別在兩個無菌且獨立的實驗室環境條件下開展污染微生物鑒定試驗，根據本次實驗具體要求，配置相應數量實驗人員，要求參與實驗的人員均要獨自完成鑒定無菌藥品的實驗任務；(3)基于國家現行《中華人民共和國藥典》規范標準，對產地、批次均不同的藥物進行無菌檢查；改良馬丁培養基與硫乙醇酸鹽為培養基樣品，且存在處于生長狀態的微生物，培養時間設置為24 h，環境溫度設置為35 ℃，本次實驗期間細菌總計收集7株；(4)將7株細菌微生物作為本次污染微生物鑒定實驗研究對象，通過一系列鑒定與分析，確定微生物污染源。

2.2 實驗方法

本次鑒定細菌微生物過程中，選擇細菌基因組DNA提取試劑盒輔助實驗人員提取微生物基因組DNA，在提前準備好的TE緩沖液中存放所提取的細菌DNA。為滿足藥品無菌檢查中污染物微生物鑒定要求，將選擇三種鑒定方法，分別是全自動微生物生化鑒定、16SrRNA基因測序鑒定方法以及RiboPrinter儀器鑒定，這三種鑒定方法主要負責細菌鑒定，其中Ribo Printer儀器分型法、16SrRNA基因同源分型法以及DiversiLab儀器分型法用于分析各菌株同源性[1]。另外，為了保證本次鑒定實驗結果準確性，要求參與鑒定實驗的人員均要具備較高專業水平和豐富的實驗經驗，確保細菌鑒定與分型實驗操作規范性、標準性，從而將微生物污染源如實反映。

2.3 實驗結果分析

2.3.1 細菌鑒定結果

本次鑒定實驗共選擇7株細菌，其中全自動微生物化鑒定、16SrRNA基因測序鑒定方法以及RiboPrinter儀器鑒定三種方法所顯示的6株細菌鑒定結果信息一致，表皮葡萄球菌為實驗室環境中的細菌。經過一系列鑒定操作，樣品鑒定結果呈陽性，分別是表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌(呈奶白色狀)、溶血葡萄球菌。

2.3.2 細菌同源性鑒定結果

鑒定與分析細菌同源性的過程中，實驗人員采用了多種鑒定法。采用Ribo Printer儀器對細菌分型后，發現溶血葡萄球菌分型無明顯變化特征，沃氏葡萄球菌與表皮葡萄球菌分別存在2種和3種結果。

采用16SrRNA基因同源分型，發現在基因水平方面，溶血葡萄球菌和沃氏葡萄球菌二者之間差異性變化較小，表皮葡萄球菌結果存在2種。通過對比此鑒定方法下細菌同源性結果，基于參照的16SrRNA基因序列，發現結果信息顯示僅存在基因突變1個。

采用DiversiLab儀器分型，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌分別存在2組、3組、2組。通過分析葡萄球菌污染源，各實驗樣品中并未出現細菌交叉污染情況，但其中一項樣品被沃氏葡萄球菌污染的幾率較高；因此環境因素并不是表皮葡萄球菌污染源，與自身因素有著十分密切的關聯性。

2.4 實驗結果討論

從藥品質量安全監管角度上分析，藥品無菌檢查工作有效性開展，不僅有利于促進藥品質量提升，在一定程度上也能起到減少臨床用藥階段誘發不良反應情況出現，是實現藥品質量安全監管落實的必要途徑。通過對目前藥品無菌檢查情況調研與分析發現，現有污染微生物鑒定方法較為多樣，如全自動微生物生化鑒定方法、16SrRNA基因測序鑒定方法等。其中生化鑒定法是現階段污染微生物鑒定過程中使用頻率較高的方法，但環境因素對此鑒定方法的使用效果有著較大影響，故該方法不適用于在過于復雜的環境中進行污染微生物鑒定[2]。

基于此，本次藥品無菌檢查中選擇多種鑒定方法輔助實驗開展。從整體上看，每項鑒定方法均獲得了較為精準的結果，雖然各鑒定方法在操作方面各不相同，但其結果信息顯示均無明顯差異。通過對照上述幾種鑒定方法所顯示的結果信息，發現6SrRNA基因測序鑒定方法在分析菌株層面方面存在明顯劣勢，難以保證菌株層面分辨率。因RiboPrinter儀器由高精密度構件組成，在較高自動化水平支持下，使得鑒定結果相較于其他鑒定方法所提供的鑒定結果其結果準確性、可靠性明顯高于后者。從藥品無菌檢查中微生物污染源追溯鑒定情況來看，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌均為諸多污染源中較為常見的幾種類型。就本次實驗研究結果發現：污染樣品的來源為溶血葡萄球菌，通過觀察各實驗樣品，并未出現樣品間交叉污染情況；來源不同的沃氏葡萄球菌會對污染期間的樣品帶來一定程度上感染影響；上述提及表皮葡萄球菌來自所在環境，但環境因素并未對樣品造成污染。為了進一步驗證藥品檢查中污染微生物鑒定結果是否與實驗過程中操作不規范相關，將采用OOS(超標結果)調查方法進行驗證，檢查藥品整個無菌檢查流程。

基于國家現行《中華人民共和國藥典》規范標準與GMP要求，具體要求如下：(1)實驗期間，所有參與實驗鑒定的人員均具備相應專業資質，對藥品無菌檢驗流程熟悉程度較高，各實驗環節均嚴格按照規范進行操作；(2)實驗全過程所涉及到的儀器設備各項參數設置均未出現誤差，并無故障問題，符合污染微生物鑒定實驗要求標準；(3)實驗期間所涉及到樣品、培養基、沖洗液等，在實驗前期均做好相應消毒殺菌工序，與無菌性實驗結果信息顯示一致；(4)針對環境中微生物檢測，僅收集到表皮葡萄球菌，其他相關環境微生物并未發現[3]。從OOS調查結果來看，藥品無菌檢查中來自實驗室檢驗期間污染的可能性最低。并加上多種鑒定方法反復對照實驗，可以確定藥品無菌檢查中微生物污染和實驗室環境因素不相關，其中樣品運輸或樣品加工環節受到污染的概率較高。因此，后期藥品無菌檢查過程中，相關人員應多關注藥品加工及運輸環節，提升對微生物污染控制重視程度，積極應用最新技術手段，為藥品無菌檢查工作高效率開展提供強力技術支持，從根本上保障藥品質量安全。

3 加強藥品無菌檢查中微生物污染控制的有效建議

上述提及到藥品無菌檢查中微生物污染與實驗室環境不相關，但藥品加工及運輸環節導致微生物污染問題發生的概率較高。基于此，下面將著重闡述對這兩方面加強監管的措施，減少微生物污染情況出現。

3.1 人員方面

據數據顯示，由于人員操作方面因素導致無菌藥品中微生物含量超標的概率最高，高達70%左右。為了進一步加強對人員操作方面管控，應根據國家現行規定標準，明確制定無菌操作流程，并要求進入操作室的任何人員均要進行全面消毒，并對無菌操作區內的人員數量加以控制，一方面減少無菌操作區運動頻率，規范人員操作行為，防止污染源出現；另一方面針對非加工人員進入無菌操作區，如：參觀人員、設備維修人員以及質檢人員等，均要在專業人員監督與指導下進入無菌操作區，待做好消毒程序后，方可進入無菌操作區，降低此方面出現微生物污染可能性。除此之外，無菌操作是降低微生物污染概率的必要途徑，若藥品生產人員無菌操作意識薄弱、無菌操作不規范以及個人消毒不徹底等均會導致微生物污染情況出現。因此，必須提升藥品生產人員無菌操作規范性，增強無菌操作意識，在生產加工環節嚴格按照規范流程進行無菌操作，進出無菌操作區均要消毒，切忌大幅度運動，防止人員運動帶來大量灰塵而導致微生物增多的情況出現。

3.2 設施方面

為符合國家藥品質量安全標準的無菌藥品生產前提，需要保證藥品生產環境無菌。針對無菌環境設計，需要注意以下幾點內容：

第一，嚴格區分無菌和有菌區域，藥品生產加工環節所涉及到滅菌設備均要按照規定要求并在指定區域內存放和運輸。縮短藥品生產運輸路線，盡可能減少微生物出現。

第二，做好無菌環境消毒工作。基于國家現行規定最新標準，選擇符合規范標準的滅菌工藝，如甲醛熏蒸、乳酸熏蒸等，為了更好地保證藥品生產加工環境無菌性，應根據實際生產情況，明確消毒效果最佳滅菌工藝，切實做到無菌化藥品生產和加工[4]。

第三，無菌設備選擇。以除菌過濾設備為例，為了保證藥液在過濾過程中無微生物污染情況出現，應按照GMP規定標準，選擇合適的無菌過濾設備，在過濾設備中添加雙層除菌濾芯，以此來達到有效除菌目的，從根源上規避濾芯破損而出現微生物污染問題。

第四，藥品運輸。全過程監管藥品運輸，有利于確保藥品質量安全，并符合國家規定標準。在實際藥品運輸過程中，應遵循及時、準確、安全以及規避微生物污染基本原則，嚴格按照現有藥品運輸管理制度體系開展藥品運輸各項工作。明確藥品運輸人員、藥品質量管理人員責任范疇，在藥品運輸前期，根據藥品運輸各項要求，做好運輸路線規劃與運輸工具確認工作。避免藥品運輸過程中出現不必要停留，有效縮短藥品運輸耗時。并確認所運輸的藥品是否存在包裝破損等情況，降低微生物污染概率。

除此之外，需要完善藥品運輸防護措施，如：防水、防潮、防蟲等相關措施，以預防與控制微生物污染。如運輸特殊性藥品，應按照國家相關規定執行藥品運輸各流程，以提高藥品運輸質量為原則，根據季節變化采取相應保暖與冷藏措施，規避運輸環境因素導致微生物污染問題發生，切實做到全過程、全方位監管藥品加工與運輸。

4 結語

綜上所述，污染微生物鑒定作為藥品無菌檢查過程中最為關鍵一環，通過對其的研究以調研和分析目前藥品無菌檢查情況，其中為了保證鑒定結果準確性，采用了多種不同鑒定方法。結果顯示藥品被微生物污染，與環境因素無關，其中來自藥品加工或運輸階段的污染源概率較大。因此，為了降低藥品被微生物污染風險，應重點加強對此方面管控，減少藥品使用不良反應出現，從根本上保障藥品質量。