雞鏈球菌特異性產物與毒力基因的研究

趙洪君

（桓仁滿族自治縣農業發展服務中心，遼寧 桓仁 117200）

雞鏈球菌病近年來已成為家禽養殖業面臨的重要禽傳染性疾病。研究表明，感染禽類的鏈球菌主要包括革蘭氏血清群C群獸疫鏈球菌、D群糞鏈球菌、類糞鏈球菌、堅忍鏈球菌和鳥鏈球菌。感染家禽往往出現以急性死亡、冠及肉髯蒼白、羽毛粗亂、腹瀉、癱瘓、產蛋率下降、蛋滯留等為主要臨床特征的疾病。剖檢主要表現為肝臟的病理變化，如肝臟腫大、變脆，表面出現出血點，同時可見脾臟腫大，腦膜出血，也有資料顯示會出現腹膜炎、輸卵管炎、心內膜炎、敗血癥和乳腺炎等病變。雞鏈球菌病在世界各地均有發生。

雞鏈球菌導致雞群發病，按照病情可分為急性型和慢性型。最近有研究發現，大多數急性鏈球菌病臨床幾乎沒有前兆癥狀，會突然發生敗血癥而導致雛雞群病死率迅速升高，剖檢結果顯示嚴重的敗血癥病變，出現纖維素性心包炎、腦膜炎、脾多病灶性的纖維素樣壞死，肝炎、骨軟骨炎、肌炎、氣囊炎?；茧u出現水腫，主要存在于皮下、漿膜及肌肉，并且伴有黃色膠凍樣滲出物；心包及腹腔內有滲出物，其呈現為漿液性、出血性或漿液纖維素性；肌肉有出血現象；肝臟呈暗紫色并且腫大，有時可見出血點、壞死點和肝周炎；脾臟呈圓球狀腫大，有時可見出血和壞死點；肺臟瘀血或水腫；氣管和支氣管表面有黏性分泌物，個別患雞喉頭有壞死灶，為干酪樣粟粒大小；腎臟腫大。也有患禽出現氣囊炎；產蛋雞出現卵黃性腹膜炎及卡他性腸炎，個別病例會出現腺胃黏膜出血，胃乳頭有膿性分泌物，肌胃角質糜爛。慢性型主要發生關節炎、腱鞘炎，蛋雞輸卵管炎、卵黃性腹膜炎，以及心肌、肝臟、脾臟等實質器官發生炎癥變性或梗死[1]。雞鏈球菌可以感染各種禽類及鳥類，通過糞便檢測發現養殖的火雞群中鏈球菌的檢出率達到100%，涉及到多個鏈球菌亞型，而且鏈球菌可以在家禽和鳥類間傳播[2]。

國內禽類感染的鏈球菌主要是C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌。研究人員通過對河南省不同地區發病雞群13個鏈球菌分離株進行生化分群試驗，發現雞鏈球菌病的病原主要是C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌[3]。

1 鏈球菌的特異性產物

1.1 黏附素

鏈球菌產生大量表面蛋白，能結合多種宿主胞外基質蛋白（纖連蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白、核心蛋白聚糖以及含有硫酸肝素的蛋白多糖），這些黏附素被稱為MSCRAMM（識別黏附基質分子的微生物表面成分）。一些MSCRAMM，特別是結合纖維蛋白原的M蛋白，使鏈球菌細胞具有抗吞噬活性，其包被宿主蛋白以及可調理外源顆粒的血清蛋白識別（膠原樣凝集素）的蛋白，使鏈球菌細胞的補體活化位點被掩蓋（因此調理作用降低），從而使鏈球菌能避免被機體免疫系統識別吞噬。這類蛋白包括無乳鏈球菌的FbsA蛋白、G型類馬停乳鏈球菌亞種的FOG蛋白、馬鏈球菌獸疫亞種的Szp蛋白、化膿鏈球菌的透明質酸莢膜、無乳鏈球菌的BibA蛋白等。

其他黏附素負責鏈球菌結合到宿主細胞。如F蛋白和其他蛋白質（如Fnb和SFS）結合纖連蛋白，與細菌黏附和內化相關。肺炎鏈球菌、馬鏈球菌馬亞種和馬鏈球菌獸疫亞種的PsaA（肺球菌表面黏附素）脂蛋白主要負責黏附上、下呼吸道內壁的細胞。已經有研究表明呼吸道內皮細胞的細胞結合蛋白E-cadherin是PsaA的一個受體。

1.2 莢膜

多糖莢膜是新生隱球菌最主要的毒性因子，與新生隱球菌逃避宿主免疫密切相關。某些鏈球菌產生莢膜，如常見感染雞的C群鏈球菌就產生莢膜。A群和C群鏈球菌莢膜具有相似性，均由透明質酸組成，透明質酸也是哺乳動物結締組織的構成成分，抗原性差，不容易結合補體成分，可保護鏈球菌抵抗巨噬細胞的殺傷作用和補體介導的吞噬作用。敲除鏈球菌基因可導致菌體莢膜變小，最適生長溫度也發生了變化，可見雞鏈球菌莢膜與其致病性和毒性緊密相關。但B、E和G群鏈球菌的莢膜不是透明質酸，而是多聚糖，但這類鏈球菌在雞鏈球菌中較少見。對于鏈球菌莢膜的研究多見于肺炎鏈球菌和豬鏈球菌，雞鏈球菌極少，需要進一步深入研究。

1.3 細胞壁

雞鏈球菌為革蘭氏陽性菌，其細胞壁與其他革蘭氏陽性菌相似，也含有蛋白質和多糖。研究發現革蘭氏陽性菌細胞壁蛋白質的結構域數量也不是很多，其中出現次數不小于2次的結構域只有高度保守的N端親水性結構域和調控鐵元素表面蛋白的特異性保守結構域[4]。N端親水性結構域對蛋白質的翻譯和定位起著重要作用。革蘭氏陽性細菌中攝取血紅素的最佳系統是lsd系統，在lsd系統中細胞壁作為受體將與血紅素結合，在細胞壁中發揮主要作用的就是調控鐵元素表面蛋白的特異性保守結構域[5]。革蘭氏陽性菌細胞壁的脂磷壁酸和肽聚糖與巨噬細胞相互作用，導致釋放促炎細胞因子。

1.4 化膿鏈球菌毒素超抗原

常見的超抗原同時結合MHCⅡ類分子和帶有特定V-β區的T細胞受體分子，這種結合導致抗原遞呈細胞和T細胞活化，隨之全系統釋放高水平的細胞因子。鏈球菌感染所引發的部分系統性癥狀來自毒素引發的大規模的T細胞的活化，最清楚的是化膿性鏈球菌（A群鏈球菌）產生的化膿鏈球菌毒素超抗原（Superantigen，SPE）引發的T細胞活化?；撔枣溓蚓a生若干種SPE：SPEA、SPEC、SPEG、SPEH、SPEI、SPEJ、SPEK、SPEL、SPEM、SSA和鏈球菌有絲分裂源外毒素Z（SMEZ），除了SMEZ、SPEG和SPEJ之外，其余的都位于可移動的DNA元件，化膿性鏈球菌各分離株通常均攜帶SMEZ、SPEG和SPEJ的基因，可與其他SPE基因發生多種組合。已表明馬鏈球菌馬亞種能產生SPE，包括SeeI、SeeL和SeeM，這些都可以刺激馬外周血單核細胞增殖。這些SPE是前噬菌體編碼的，在馬鏈球菌獸疫亞種中已經鑒定出3種SPE：SzeF、SzeN和SzeP，已表明也能刺激馬外周血單核細胞增殖，產生α腫瘤壞死因子（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）。

1.5 溶血毒素

鏈球菌產生大量潛在毒力因子蛋白，鏈球菌溶血毒素就是其中之一。鏈球菌溶血毒素是A群鏈球菌產生的一種外毒素，根據其在有氧條件下的穩定性分為氧-不穩定型（O）和氧-穩定型（S）溶血素，它們還原細胞裂解素，可裂解嗜中性粒細胞、巨噬細胞和血小板。溶血素S是導致β溶血綿羊血瓊脂平板大范圍β-溶血的原因。溶血素S溶細胞譜廣，包括紅細胞膜、白細胞膜、血小板、組織培養細胞和亞細胞器，如溶酶體和線粒體。而溶血素O包括氧不穩定且硫醇激活的溶血素、鏈球菌溶血素O與豬鏈球菌溶血素O，溶血素O常結合靶細胞膜內膽固醇，在靶細胞膜上或者膜內發生寡聚作用，形成疏水性蛋白復合物，與親水性通道在膜內整合，形成較大的孔徑（達到30 nm），從而破壞機體正常細胞。

1.6 鏈激酶

鏈激酶（Streptokinase，SK）是由A、C、G群鏈球菌中溶血性鏈球菌分泌的一種異質性纖溶酶原（Plasminogen，Pg）激活蛋白，屬于胞外非酶蛋白質，是由三個結構域組成的毒力因子：SKα/SKβ/SKγ，其作用于宿主蛋白，包括纖維蛋白，能減少血栓。鏈激酶不能直接使纖溶酶原激活，而是和Pg形成等分子復合物，使纖溶酶原發生構象改變，從而暴露出活性部位。該活性部位催化纖溶酶原轉變為纖溶酶（plasmin，Pm），從而溶解血栓。研究發現SK的1~59個氨基酸殘基通過非蛋白水解機制調節其在結合的Pg中誘導活性位點的能力，并以非纖維蛋白依賴性的方式激活底物Pg[6]。研究SK的a區域的作用時發現，SK的該區域能激活Pg中的谷氨酸（glutamic acid，Glu）、賴氨酸（lysine，Lys）及Pm的Lys熒光素標記，進一步揭示了SK的分子機制[7]。

2 毒力基因的調控

目前研究發現，至少有三個系統調節化膿性鏈球菌毒力相關基因的表達：第一個是未知的“生長階段相關信號”，但某些基因在靜止期上調（包括編碼鏈球菌溶血素S和DNA酶的基因），而其他基因，包括編碼莢膜、鏈激酶、鏈球菌溶血素O和A群鏈球菌的多基因調控子基因（Mga）在指數生長后期上調。轉錄調節蛋白通過調節基因表達的活化和抑制實現調節，主要調節蛋白包括：Mga，負責在指數生長期激活表達涉及黏附、內化和免疫逃避的基因；RofA樣蛋白，包括ROFA和NRA，調節涉及持續感染的基因；FasA，涉及毒力基因在生長周期的表達；Rgg（RopB），激活胞外蛋白的表達，如SpeB半胱氨酸蛋白酶。Mga自身受生長周期及其他未知環境因素的影響。CovRS（毒力的控制）雙組分調控系統直接或間接調節15%的基因組。若干重要的毒力基因的表達直接受CovR應答調節蛋白的調節，包括透明質酸莢膜操縱子、鏈球菌溶血素S、鏈激酶編碼基因、speB和sda。

大多數與獸醫有關的鏈球菌共生于上呼吸道、消化道和下生殖道。鏈球菌通過呼吸、性和先天性傳播，以及接觸性傳播。鏈球菌主要引起皮膚、呼吸道、生殖道、臍部和乳腺的化膿性感染，原發感染后通過血行播散可能導致敗血癥。在臨床上，鏈球菌病通常以發熱、單獨或聯合敗血癥為特征[8]，常見繼發毒血癥和免疫介導性疾病?；静±磉^程類似于葡萄球菌感染，病灶有膿液排出，排膿受阻的地方形成膿腫，典型病灶為炎癥反應性膿腫，在膿腫中存在宿主細胞碎片和活菌、死菌，鏡檢可見完整的白細胞和纖維蛋白絲圍繞著膿液，若不及時排膿會逐漸形成纖維素性囊。健康個體可能攜帶上述所有鏈球菌，許多感染可能是內源性的，與應激有關。針對雞鏈球菌的報道目前多集中在防治方面，病原分子生物學特性、致病機理等深入研究未見報道，可能和雞鏈球菌病涉及到的鏈球菌種類繁多有關，但這些鏈球菌有很多共性，而且常見感染雞并引起嚴重后果的多為C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌，針對性深入研究將有助于雞鏈球菌病的防控。