豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒2型與弓形蟲混合感染的診斷與預防

吳曉曉，萬新軍，俞進，段真真，賈毅飛，何宗霖

（1.阿克蘇地區動物疫病控制診斷中心，新疆 阿克蘇 843000；2.阿克蘇地區畜牧技術推廣中心，新疆 阿克蘇 843000）

豬肉肉質鮮美、營養豐富，是日常生活中最為常見且重要的優質肉源。發展養豬業不僅能有效保障肉食品的供應，也可為農民提供一條致富增收的途徑，從而推動鄉村振興發展。目前，養豬業已成為了我國農村經濟的一大支柱產業，也是我國農業發展不可或缺的一部分。近些年，我國養豬業由原來傳統的散養模式逐漸向規?；⒓s化的現代養殖模式轉變與發展，生豬的生產性能得到了快速的提高，但生豬疫病的種類及暴發頻率也逐漸增加，疫病混合感染已成為規模化豬場疫病防控的一大難題。豬繁殖與呼吸綜合征是一種急性高接觸性傳染病，具有很高的發病率和死亡率，是生豬養殖中最為常見的疾病。豬圓環病毒病是一種免疫抑制性傳染病，主要損害生豬免疫系統，造成其生產性能下降，易引發仔豬死亡，通常與豬呼吸與繁殖綜合征混合感染，兩種病原體在生豬體內能相互促進復制，從而降低了生豬的抗病能力，出現誘發繼發性感染，如感染弓形蟲病、口蹄疫及豬流感等疫病，最終加大治愈難度和誘發更高的死亡率，給養豬場造成極大的危害。

1 流行病學

1.1 病原體

豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約為15 kb，有囊膜；病毒粒子呈圓形，直徑大小為50~60 nm；核衣殼的結構為對稱的20面體，直徑為25~30 nm[1]。該病毒分為歐洲型和美洲型，兩種基因的同源性不超過60%，而氨基酸同源性78%~81%，在我國主要流行的是美洲型。該病毒對高溫較為敏感，56℃條件下加熱45 min便會完全失活，室溫及37℃以下均不能存活；該病毒最適生存pH值為5~7，其感染力最強[2]。另外，該病毒對常見的消毒劑敏感，低劑量的乙醚和氯仿便可將其殺死消滅。

豬圓環病毒屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是一種是單股負鏈DNA病毒，基因組大小為1 758~2 001 bp，無囊膜；病毒粒子呈圓形，直徑為14~25 nm，核衣殼結構為20面體，是已知的最小動物病毒之一[3]。該病毒具有4種基因型，豬圓環病毒2型為其中致病性最強的類型，于19世紀90年代末在南美洲發現。該病毒可在豬腎細胞、豬睪丸細胞和豬肺泡巨噬細胞中增殖，損害生豬的免疫系統，通常會引起仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸系統疾病綜合征及繁殖障礙性疾病[3]。該病毒對外界環境具有較強的抵抗力，對乙醚和氯仿的敏感性較低，常見的消毒劑不易將其殺死。

弓形蟲屬于球蟲綱球蟲目孢子蟲科，體長4~10 μm，是一種廣泛寄生在人和動物體內有核細胞內的寄生性原蟲。弓形蟲的生殖包含有性生殖和無性生殖，其生活史包括5個階段，第一階段為滋養體期，滋養體在有核細胞內快速分裂并占據宿主的細胞漿，形成假包囊；第二階段為緩殖子期，弓形蟲在囊壁內緩慢增殖形成包囊；第三階段為裂殖體期，緩殖子在動物的小腸上皮細胞內裂體增殖，形成裂殖子；第四階段為配子體期，配子受精形成合子，發育成卵囊；第五階段為子孢子期，卵囊內的孢子體發育繁殖，形成2個孢子囊，每個孢子囊分化成4個子孢子。處于不同的發育階段，呈現不同的形態，其滋養體和包囊均可使中間宿主和終末宿主感染發病[4]。

1.2 傳播途徑

豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環病毒病主要通過消化道和呼吸道進行傳播。病豬和帶毒豬為直接傳染源，其排出的糞便、尿液及唾液等分泌物中含有大量的病毒，健康豬只通過接觸污染的飼料、飲用水、飼養工具、墊草及空氣均會感染。同時，該病毒還可通過受精及胎盤進行傳播。此外，該病毒還可以通過蚊蟲、蒼蠅、蜱蟲等進行傳播。弓形蟲病主要是由于生豬食入含有蟲體的飼料或者飲用了含有生肉屑的泔水而發生感染。

1.3 流行特點

任何品種、任何年齡及任何性別的豬均可感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒，1月齡的仔豬及妊娠母豬感染率最高；該病呈地方流行性，往往急性發病，沒有明顯的季節性，但在蚊蠅滋生的季節發病率會更高。豬圓環病毒病各品種和各年齡的生豬均會感染，且6~12周齡的生豬最易感染；該病全年均會發生，但多發于夏季及秋季。豬弓形蟲病任何品種和年齡的生豬均會感染，其中3~6周齡的仔豬和妊娠母豬發病率最高，而成年豬多呈隱形感染；該病主要發生在夏秋季節。通常情況下以上3種病原體均不易侵入生豬機體，但如果飼養管理不當、環境衛生較差、斷奶應激或天氣驟變就會引發感染。

2 臨床癥狀

感染豬繁殖與呼吸綜合征的病豬主要表現為精神萎靡，食欲減退，發熱，咳嗽氣喘，呼吸困難。妊娠母豬出現體溫升高，食欲下降，精神不振，呼吸困難，流產、早產或產下死胎、弱胎，產后無乳，胎衣不下，以及產道分泌物增多，以后發情不正常，甚至出現繁殖障礙；產下的仔豬孱弱、發熱、呼吸困難、腹瀉嚴重，死亡率高達80%，而耐過仔豬多數會成為僵豬；種公豬配種能力下降，精子帶毒，且其數量減少、質量下降，甚至出現畸形；育肥豬出現共濟失調，站立不穩，被毛粗亂，其耳部、尾部及腹部的皮膚發紺，有的會出現結膜炎。

感染豬圓環病毒2型的病豬主要表現為食欲不振，精神萎靡，嗜睡，吻突干燥，流涕咳嗽，持續腹瀉，機體消瘦，四肢呈暗紅色，出現“接地紅”現象。

感染弓形蟲病的病豬主要表現為體溫升高至41℃以上，典型的腹式呼吸，呼吸急促，采食量下降，被毛雜亂無光澤，皮膚呈紫紅色的斑點或者紅色小點，鼻腔流出泡沫樣鼻涕，排出帶血糞便，后軀無力，臥地不起。

以上3種疫病混合感染后主要表現為精神不振，厭食至食欲廢絕，發熱，腹式呼吸且呼吸困難，咳嗽氣喘，嗜睡，被毛粗亂，四肢無力，站立不穩，流產，早產或產死胎、弱胎，繁殖功能下降，耳部、尾部及四肢皮膚呈紫紅色發紺，腹部出現紅斑，混合感染會增加治療難度，死亡率可高達85%~100%。

3 實驗室診斷

目前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒2型病毒和弓形蟲常采用血清學診斷方法和分子生物學診斷方法進行確診，其中血清學診斷方法主要包括免疫過氧化物酶單層試驗、間接免疫熒光試驗和酶聯免疫吸附試驗。

免疫過氧化物酶單層試驗的原理是通過將抗原吸附在固相載體上，加入被檢樣品形成抗原抗體的復合物，然后再加入酶標記的抗抗體，底物參與下顯色，并通過顯微鏡判斷結果。該方法的操作步驟如下：首先在無菌條件下采集病豬的血液，分離獲得血清，保證血清透明無污染不溶血，將血清依次按四倍比例稀釋，做好對照，然后分別取稀釋血清各50 μL加入固定診斷板中，封板，37℃孵育1 h后倒去板中液體，用洗板液清洗3次，每次清洗1~3 min，之后倒置吸附紙上吸干水分；隨后每孔加入辣根過氧化物酶標記的兔抗豬抗抗體50 μL，封板后37℃放置感作1 h；倒去板中液體，按上述的洗滌方法清洗3次，吸干水分；每孔再加入氨乙基咔唑50 μL，封板避光放置18~24℃條件下感作30 min，顯微鏡下觀察，若孔內30%~50%的細胞間質為深紅色，則說明感染了豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該方法存在一定的主觀性，有時也會出現假陰性，不是特別適合大規模的檢測應用。

間接免疫熒光試驗的原理是通過將抗原吸附在固相上，加入被檢細胞孵育結合形成抗原抗體復合物，再加入偶聯有熒光素分子的抗抗體，與細胞孵育結合后在熒光顯微鏡下觀察。具體操作步驟如下：無菌條件下采集病豬血液，分離血清，稀釋，加入固定板中，加入配好的固定液，室溫孵育10 min，棄液，用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，再添加封閉液37℃靜置1 h；再用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，用濾紙吸取多余的水分，隨后加入熒光標記的兔抗豬抗體溶液，使其完全覆蓋樣本，放置搪瓷盒中37℃保溫處理30 min；再用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，吸去多余水分，但樣本保持一定的濕度，滴入甘油，放置熒光顯微鏡下觀察熒光強度，根據熒光強度判斷陽性。該方法需要專業的檢測人員，且檢測時間相對較長，但具有較好的特異性和敏感性，目前在臨床上也較為常用。

酶聯免疫吸附試驗的原理是通過用特異性抗體包被于固相載體，經洗滌后加入含有抗原的待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在即可與包被在固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌后，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為預測抗原的量。具體步驟如下：首先無菌條件下采集病豬血液，分離血清，4℃保存待檢；再用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度，每孔加入200 μL，4℃過夜；再用磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，去除包被液，拋干；隨后取病豬血清，稀釋，加至孔中，37℃孵育1 h；再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，拋干；隨后加入200 μL酶標抗體，37℃作用1~2 h（具體時間需要通過預試驗確定）；再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，拋干；加入200 μL底物溶液，室溫作用30 min，再加入2 mol·L-1檸檬酸50 μL以終止反應；最后用分光光度計測定OD值。該方法的靈敏性和特異性高，操作簡單且快速，不要求特殊設備，成本較低，適合大范圍大批量的樣品檢測，是目前使用最為廣泛的方法之一。

分子生物學診斷方法是通過PCR手段進行檢測，主要包括RT-PCR和實時熒光定量PCR（qPCR）。RT-PCR具體操作步驟如下：首先根據Gen-Bank中公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒2型病毒和弓形蟲的開放閱讀框基因序列設計引物，然后根據相應的DNA提取試劑盒提取總RNA，隨后構建RT-PCR反應體系，50℃逆轉錄30 min，94℃預變性5 min；94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，再取10 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增目的片段，得到相應片段說明感染該病原體。qPCR是在RT-PCR的基礎上，通過增加熒光探針，建立標準曲線可確定病毒感染量的大小。具體步驟如下：首先引物的設計和總RNA的提取過程和RT-PCR是一致的；然后根據相應試劑盒構建qPCR反應體系，并構建標準曲線，反應條件：42℃反轉錄5 min，95℃預變性10 s；95℃退火5 s，60℃延伸35 s，40個循環。以C值≤35并出現特定的擴增曲線判定為陽性。與其他方法比，該方法具有檢測組織多樣化、檢測速度快、靈敏度和特異性最高等特點，同時還能區分高致病毒株和野生型毒株，也是目前使用最為廣泛的方法之一。

此外，弓形蟲的診斷還可以通過姬姆薩染色法。取病死豬肺部組織或淋巴結進行涂片，通過姬姆薩染色，可觀察滋養體的形狀多樣，呈半月形、梨形或梭形，其一端略鈍，一端略尖，其核處于中央或者略微偏向鈍端，且被染成深藍色，則可確定感染弓形蟲[4]。該方法操作簡單，成本低廉，非常適合檢測急性弓形蟲的感染；但該方法對檢測人員的專業要求較高，且發病豬如果采取了藥物治療，其體內的弓形蟲數量會減少，可能會對檢測結果具有一定的影響。

4 預防措施

第一，重視豬舍消毒及衛生管理工作；及時清理欄舍糞污，定期對欄舍內外和飼養工具進行徹底的清洗及消毒，并做好防蟲鼠、飛鳥措施，避免蟲鼠滋生及隨意出入欄舍；同時欄舍需全封閉式管理，禁止外來人員及車輛進出。第二，提供干燥、舒適的飼養環境；定期檢修水電氣設備，保障適宜的溫度、濕度，控制飼養密度，保證通風效果良好。第三，均衡營養，合理飼喂；做好飼料管理，合理搭配飼料，定時定點飼喂，提供干凈、充足的飲水。第四，強化檢疫工作，及時進行疫苗免疫；養殖過程中需實時監測豬群健康動態并做好記錄，根據當地疫病流行特點及時制定并實施疫苗免疫，另外，對病豬及時隔離處理，必要時撲殺并無害化處理。