紅三葉草提取物中四種異黃酮的HPLC檢測方法

李彥軍，鄭 楠，王加啟，趙圣國

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193）

大豆苷元、染料木素、鷹嘴豆素A和刺芒柄花素是異黃酮類植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物學功能（Ludmila等，2019）。研究表明，日糧中添加大豆異黃酮可以改善動物的內激素水平（肖凡等，2020），提高斷奶仔豬（林廈菁等，2020）、荷斯坦奶牛犢牛（肖凡等，2020）和羊的生長性能（毛玉平等，2019），以及機體的抗氧化能力（林廈菁等，2020）。大豆苷元和染料木素可以緩解奶牛泌乳后期產奶量的下降趨勢，在一定程度上提高產奶量，乳蛋白質含量也明顯增加（沈菲等，2020；Zhu等，2006），這可能是由于大豆苷元和染料木素促進了牛乳腺上皮細胞的增殖（劉春龍等，2010）。大豆苷元和染料木素還可以提高鳥類的產蛋性能和蛋殼質量，提高飼料轉化效率（Cai等，2013；Akdemir等，2009）。另外，鷹嘴豆素A能改變瘤胃微生物的菌群結構，促進纖維素降解，提高日糧中蛋白質的利用率和肉牛的平均日增重，以及緩解瘤胃酸中毒（Harlow等，2021，2017a，2017b；Flythe等，2013）。紅三葉草（Lemeziene等，2015）是大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的主要來源。紅三葉草是多年生的豆科植物，營養豐富、蛋白質含量高，是我國主要的牧草之一（鞏建峰，1996）。因此紅三葉草也是反芻動物攝入刺芒柄花素和鷹嘴豆素A等異黃酮的主要來源。王凱等（2017）表示紅三葉草和苜蓿提取物可以提高羔羊的平均日增重和飼料轉化率，這主要取決于鷹嘴豆素A與刺芒柄花素等其他異黃酮的交互作用（Harlow等，2020），這表明紅三葉草提取物是一種潛在的可以提高動物生產性能和飼料轉化率的天然飼料添加劑。

為了開發紅三葉草提取物的相關產品，需要開發一種能夠快速、全面、準確地測定產品中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC方法。目前，異黃酮的檢測方法主要有紫外分光光度法（陳寒青等，2005）、氣相色譜-質譜法（Iannone等，2019；Hossain等，2019）和高效液相色譜法/高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）（Zhou等，2020；李天雪等，2018；張念等，2011；Krenn等，2006；Delmonte等，2006）。HPLC法具有特異性強、靈敏度和準確性高的特點。雖然檢測異黃酮的HPLC方法較多，但是能夠同時檢測紅三葉草提取物中鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的方法較少。因此，本實驗旨在建立一種可以同時測定紅三葉草提取物中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC檢測方法，以期為紅三葉草提取物產品中四種異黃酮的檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Waters 2695高效液相色譜儀（Waters）；2998二極管陣列檢測器（Waters）；KH-250DB型數控超聲波清洗器（昆山禾利超聲儀器有限公司）。

鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標準品全部購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度均≥98%；甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司；無水磷酸氫二鈉和鹽酸均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為雙蒸水；6號溶劑購自武漢奧萊特生物科技有限公司；紅三葉草來自甘肅省岷縣。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為χBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流動相為甲醇（A）和10 mmol磷酸氫二鈉溶液（B）；柱溫為40℃；檢測波長為270 nm；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；洗脫梯度見表1。

表1 流動相洗脫梯度%

1.2.2 標準曲線的制作

1.2.2.1 標準溶液儲備液的配制 分別準確稱取鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標準品20 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，配制成濃度為200 μg/mL的儲備液，于-20℃以下保存。

1.2.2.2 混合標準工作溶液的配制 分別準確量取10 mL上述標準品儲備液于50 mL離心管，混勻，然后準確移取適量混合標準品溶液稀釋，配成系列標準工作溶液，濃度分別為50、25、15、10、5、1 μg/mL。

1.2.2.3 標準曲線的制作 分別量取1 mL上述系列混合標準工作溶液通過0.45 μm濾膜。按照從低濃度到高濃度的順序依次進樣，每個樣品連續進樣兩次，取平均值。以標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到各標準品的回歸方程。

1.2.3 紅三葉草提取物的制備 稱取已經粉碎的紅三草，加入10倍量80%的乙醇回流提取2次（每次2 h），過濾，合并提取液并減壓濃縮，然后加入5倍量的熱水（85℃以上）攪拌，冷卻至室溫后10000 g離心得到沉淀，加入5倍量的6號溶劑充分攪拌脫脂2次（每次2 h），最后10000 g離心，將沉淀物進行干燥得到紅三葉草提取物。

1.2.4 檢出限與定量線 將標準品混合溶液不斷進行稀釋，通過上述色譜條件進行檢測，以3倍信噪比（S/N=3）時的濃度為最低檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）時的濃度為最低定量限。然后重復測定5次最低檢出限和最低定量限濃度的標準溶液，記錄峰面積和信噪比。

1.2.5 精密度 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標準品溶液，在上述色譜條件下連續進樣5次，測定其峰面積，并計算相對標準偏差。

1.2.6 穩定性 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標準品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照上述色譜條件進樣，測定其峰面積，并計算相對標準偏差。

1.2.7 加標回收率 準確稱取4份6.25 mg紅三葉草提取物，1份測定本底值，另外3份分別添加25、12.5 mL和7.5 mL濃度為50 μg/mL的混合標準品溶液，每份樣品加鹽酸甲醇溶液（1 mol/L鹽酸）超聲溶解后定容至50 mL容量瓶，每個水平制備5個平行樣品，在上述色譜條件下測定四種異黃酮的含量，計算加標回收率。

2 結果

2.1 洗脫梯度的確定 本研究采用甲醇（A）和10 mmol的磷酸氫二鈉溶液（B）作為流動相在不同的梯度洗脫下進行洗脫。結果表明，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在表1所述的洗脫梯度下分離效果良好，而且保留時間穩定（圖1）。

2.2 檢測波長的選擇 通過對混合標準品溶液在210～400 nm波長進行全掃描（圖2）發現，鷹嘴豆素A和染料木素在270 nm處具有最大吸收峰，281 nm和260 nm處 的吸收峰次 之，254 nm處的吸收峰最小，而大豆苷元和刺芒柄花素的響應值則是254 nm＞260 nm＞270 nm＞281 nm。因此，選用270 nm作為檢測波長。

圖2 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的光譜圖和其在不同波長下的HPLC色譜圖

2.3 柱溫的選擇 由圖3可以看出，在上述色譜條件下，柱溫為40℃時保留時間最短，吸收峰最大，35℃時保留時間次之，吸收峰最小，而30℃時保留時間最短，吸收峰僅次于40℃。所以40℃為最佳柱溫。

圖3 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在不同柱溫下的HPLC色譜圖

2.4 保留時間、最低檢出限與最低定量限 四種紅三葉草異黃酮保留時間、最低檢出限和最低定量限的實驗結果見表2。大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的保留時間為（7.09±0.01）、（7.97±0.01）、（12.12±0.02）min和 （13.60+0.02）min，色譜峰分離效果良好；最低檢出限分別為0.07、0.08、0.10 μg/mL和0.07 μg/mL；最低定量限分別為0.18、0.26、0.40 μg/mL和0.20 μg/mL。

表2 四種異黃酮的保留時間、最低檢出限和最低定量限

2.5 標準曲線 由表3可知，在濃度為1～50 μg/mL時，大豆苷元（Y=71654X-30703）、染料木素（Y=71340X+1728）、刺芒柄花素（Y=50078X+29669）和鷹嘴豆素A（Y=75607X+36375）均具有良好的線性關系，線性方程的R2均大于0.999。

表3 四種異黃酮的線性關系

2.6 精密度 由表4可知，結果顯示，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A峰面積的RSD分別為1.80%、1.98%、1.35%和1.72%，表明該方法的精密度良好，符合分析方法對精密度的要求（李正邦，2016）。

表4 精密度實驗結果

2.7 穩定性 由表5可知，看出大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在常溫下24 h時內峰面積的RSD分別為1.14%、0.90%、1.16%和1.06%，均小于1.2%，表明紅三葉草提取中的這四種異黃酮在室溫下放置24 h穩定性良好，符合分析標準的要求（李正邦，2016）。

表5 穩定性試驗結果

2.8 加標回收率 由表6可以看出，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的平均加標回 收 率 分 別 為96.24%、100.05%、99.51%和100.18%，RSD分 別 為0.66%、0.94%、0.96%和0.95%，表明該方法具有較高的加標回收率，滿足加標回收率為80%～120%，RSD＜10%的要求（李正邦，2016）。

表6 加標回收率的實驗結果

3 討論

3.1 洗脫梯度的確定 異黃酮在梯度洗脫時的保留時間和分離效果與有機相的起始比例密切相關。有機相起始比例越小，保留時間越長，分離效果越好（劉文靜等，2017；張念等，2011；Krenn等，2002），因此確定甲醇的起始比例為20%。為了在縮短保留時間的同時提高分離效果，本試驗發現在0～5 min將甲醇的比例從20%提高到40%時大豆苷元和染料木素能夠完美分離，之后在5～20 min內將甲醇比例從40%提高到75%時刺芒柄花素和鷹嘴豆素A也能完美分離。因此確定了上述洗脫梯度，保證四種異黃酮分離后在短時間內洗脫掉其他干擾物質，同時平衡色譜柱，為下一次進樣做準備。

3.2 柱溫的選擇 一般柱溫越高，保留時間越短，但是溫度過高會降低色譜柱的使用壽命，因此文獻中報道最多的柱溫是30、35、40℃（劉文靜等，2017；Gao等，2015；Urpi-Sarda等，2008）。本實驗結果表明，40℃時保留時間最短，吸收峰最大，35℃時的保留時間次之，30℃時保留時間最長，但是35℃時的吸收峰小于30℃的吸收峰。因此，實驗選擇40℃為最佳柱溫。

3.3 檢測波長的選擇 據報道，鷹嘴豆素A的最大吸收波長為260 nm（Delmonte等，2006），也有研究以254 nm和281 nm為檢測波長（李天雪等，2018；張念等，2011；Mustonen等，2006；Krenn等，2002）。在210～400 nm對鷹嘴豆素A等進行全波長掃描時發現，鷹嘴豆素A的最大吸收波長為270 nm，且該波長下具有良好的精密度和線性關系，這與Montero等（2018）報道稱，270 nm處監測時線性關系差有所不同。另外，光譜圖和色譜圖顯示染料木素和鷹嘴豆素A的最大吸收波長均為270 nm，在281 nm和260 nm處具有相同的吸收峰，在254 nm處的吸收峰最小；而大豆苷元和刺芒柄花素的最大吸收波長為255 nm，281 nm處的吸收峰最小，其次是270 nm和260 nm的吸收峰。

4 結論

本實驗建立了一種同時檢測鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的HPLC檢測方法，并通過方法分析學從線性關系、檢出限、定量限、穩定性、精密度和加標回收率等方面對方法進行了評價，結果都符合分析標準的要求，可用于同時檢測紅三葉草提取物中的四種異黃酮。