響應面法優化混合益生菌發酵銀杏葉藥渣工藝條件的研究

張惠捷，羅盟錡，王金龍，黃海東，陳帥君，吳 疆

（天津農學院，農學與資源環境學院，天津 300392）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）屬銀杏科、銀杏屬植物，是我國獨有的樹種之一；銀杏葉是它的干燥葉，性平、味甘、苦、澀等，主要成分是黃酮類、萜烯內酯類化合物（楊芳等，2018）；具有活血化瘀、平喘、降脂的功效，除此之外銀杏葉中的黃酮還具有抗炎癥、抗酶活性等效用（宋立立等，2020；丁立好等，2019）；銀杏葉中的黃酮可作為綠色環保的添加劑添加在飼料生產中，銀杏葉渣是銀杏葉提取物（EGB）提取后剩下的殘渣，每年我國產生數萬噸的銀杏葉渣，其中大量的成分還未被充分利用，此時若直接加入飼料中進行生產，一方面動物無法進行吸收利用，另一方面其中還殘留著銀杏酸等有毒物質，會造成一些難以預料的影響；近年來，微生物發酵飼料成為新的研究熱點，微生物可以降解銀杏葉中的細胞壁，釋放出其中還未被充分利用的物質，還能對銀杏酸等有毒物質進行降解，達到減毒的目的，提高對銀杏葉藥渣的綜合利用率（周昊等，2014）。本研究以銀杏葉藥渣為原料，以黃酮含量的變化率、銀杏酸的降解率為指標，對其發酵條件進行優化，為提升銀杏葉中物質的綜合利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 銀杏葉：市售銀杏葉；混合益生菌凍干粉：安徽仁微保健品有限公司，內含動物雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、干酪乳桿菌、青春雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌，活菌數為3×1012個/g；MRS液體培養基。

1.2 試驗儀器UV-2100紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公式；HNY-2102恒溫培養振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；AR124CN電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；MJ-WBL2501A粉碎攪拌機：美的集團。

1.3 混合益生菌發酵銀杏葉藥渣工藝流程 市售銀杏葉→挑選→烘干→粉碎→煮沸，棄藥液→烘干→混合MRS培養基→高溫滅菌→接種混合益生菌→恒溫搖床發酵→成品→分析測定。

銀杏葉藥渣+MRS液體培養基，121℃，滅菌20 min，27℃冷卻。在發酵液中加入復合益生菌凍干粉劑，混勻后取1 mL上清，測定其菌量、黃酮含量、銀杏酸含量。置于搖床培養（150 r/min、38℃），發酵后，混勻后取1 mL上清，測定其菌量、黃酮含量、銀杏酸含量。以黃酮含量變化率（加入復合益生菌凍干粉發酵后黃酮的含量/未加入復合益生菌凍干粉前黃酮的含量，下同）、銀杏酸降解率（未加入復合益生菌凍干粉前銀杏酸的含量-加入復合益生菌凍干粉發酵后銀杏酸的含量/未加入復合益生菌凍干粉前銀杏酸的含量，下同）、菌量變化率（加入復合益生菌凍干粉發酵前的菌液中菌量/加入復合益生菌凍干粉發酵后的菌液中菌量，下同）為指標，對發酵條件進行優化。

1.4 標準曲線的繪制

1.4.1 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法繪制黃酮標準曲線 參考李仁杰等（2019）方法，選取六只25 mL的玻璃具塞刻度試管，用標簽紙將其從1到6按順序編碼。按編號順序準確取用蘆丁標準品（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL）。再精密量取70%乙醇使得每管體積皆是1 mL。用移液管準確取用1 mL 5%亞硝酸鈉，靜置等待其充分反應6 min。準確取用1 mL 10%硝酸鋁，靜置等待其充分反應6 min。分別加入10 mL 4%氫氧化鈉。用乙醇稀釋到25 mL刻度位置，搖晃試管，靜置等待其充分反應15 min。在510 nm的波長下依次檢測吸光度，收集并整理數據。將蘆丁濃度作x軸，在波長510 nm條件下測得的吸光度值作y軸，制備標準曲線，獲得回歸直線方程為：y=0.9809x-0.0008，R2=0.9985。

1.4.2 黃酮的測定方法 黃酮的最大吸收峰位于510 nm處，采取紫外分光光度法在最大吸收峰處測定吸光度，具體參考肖珊美等（2020）方法。

1.4.3 銀杏酸標準曲線的繪制 銀杏酸的最大吸收波長為307 nm，采取紫外分光光度法，在307 nm處測定其吸光度，選取六只25 mL的玻璃具塞刻度試管，用標簽紙將其從1到6按順序編碼。按編號順序稱取一定量的銀杏酸并成倍增加，再用無水甲醇精確定容至25 mL刻度線。配制成系列梯度濃度的銀杏酸標液，在307 nm的波長下依次檢測吸光度，收集并整理數據。將銀杏酸濃度作x軸，在波長307 nm的前提條件下測得的吸光度值作y軸，制備標準曲線，獲得回歸直線方程為：y=8.6451x+0.0449，R2=0.9995。

圖2 銀杏酸濃度標準曲線

1.4.4 銀杏酸的測定方法 銀杏酸的最大吸收峰位于307 nm處，采取紫外分光光度法在最大吸收峰處測定吸光度，具體見秦俊哲等（2012）方法。

1.5 銀杏葉發酵條件的篩選

1.5.1 單因素發酵試驗 采取單因素試驗，以發酵產物中的黃酮含量變化率、銀杏酸降解率和菌液中菌量的變化率為主要參考對象，對料液比（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）、接種量（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 g/mL）、發 酵 時 間（9、12、15、18、21、24 h）三個發酵條件進行篩選，依次改變銀杏葉藥渣與MRS液體培養基的料液比（m銀杏葉：V培養基=g/mL）、混合益生菌凍干粉接種量（m凍干粉/V培養基=g/mL）、發酵時間（h）進行單因素試驗，考察發酵對黃酮含量、銀杏酸含量變化的影響，以黃酮升高、銀杏酸降低、菌量穩定為優先原則，篩選出符合這三個因素的發酵條件。

1.5.2 料液比的確定 在250 mL的三角瓶中裝入混合好的銀杏葉藥渣，選取接種量為3%，發酵時間為24 h，依次改變銀杏葉藥渣與MRS培養基的料液比（m銀杏葉：V培養基=0.05、0.10、0.15、0.20），在38℃，發酵時間24 h，搖床轉速150 r/min，測定其菌量、黃酮及銀杏酸的含量。

1.5.3 接種量的確定 在料液比確定情況下，選取發酵時間為24 h，在250 mL的三角瓶中裝入混合好的銀杏葉藥渣，依次改變培養基接種量（m凍干粉/V培養基=1%、2%、3%、4%、5%），在38℃，發酵時間24 h，搖床轉速150 r/min，測定其菌量、黃酮及銀杏酸的含量。

1.5.4 發酵時間的確定 在上述料液比、接種量確定的情況下，在250 mL的三角瓶中裝入混合好的銀杏葉藥渣，依次改變培養基發酵時間（9、12、15、18、21、24 h），在38℃，搖床轉速150 r/min，測定其菌量、黃酮及銀杏酸的含量。

1.6 混合益生菌發酵銀杏葉藥渣的響應面優化試驗 在單因素試驗結果基礎上，選取料液比（A）、接種量（B）、發酵時間（C）三個因素的水平值，以發酵前后銀杏酸降解率（R1）、黃酮含量變化率（R2）為考察因素，用Box-Behnken試驗設計原理，利用Design-Expert 12.0工具，對響應面進行設計，每組試驗重復三次，響應面試驗因素與水平如表1。

表1 混合益生菌發酵銀杏葉渣響應面試驗因素與水平

2 結果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對黃酮、菌液、銀杏酸含量變化的影響 由圖3、圖4可看出，隨著料液比的升高，發酵過程中菌量變化呈現先增后減的趨勢，進而影響銀杏葉發酵前后的銀杏酸降解率和黃酮的含量變化，使之也呈現先升后降的趨勢，當料液比為0.1、0.15時，銀杏葉藥渣發酵中菌量變化、銀杏酸降解率和黃酮含量變化率較高，且變化差異不大，此時的黃酮含量與銀杏酸降解率處于較高水平，由此可以看出，混合益生菌的生長繁殖與料液比變化緊密相關，從而影響兩個指標的變化，料液比過低時，含水量較少，此時混合培養基較為黏稠，不利于混合益生菌的生長，也不利于混合益生菌對其中成分的利用、對其他成分的降解發酵；當料液比過高時，此時含水量較高，則可能導致其中的有效營養物質濃度相對較低，不足以提供此時混合益生菌的充分生長，降低了混合益生菌的生長速率；因此，在適宜的料液比條件下，混合益生菌生長狀態良好，發酵才能徹底。由此，選取0.06、0.13、0.20作為下一步優化的條件。

圖3 料液比對銀杏葉發酵中菌量變化和銀杏酸降解率的影響

圖4 料液比對銀杏葉發酵中菌量變化和黃酮含量變化率的影響

2.1.2 接種量對黃酮、菌液、銀杏酸含量變化的影響 由圖5、圖6可看出，隨著接種量的升高，發酵過程中菌量變化和黃酮含量變化以及銀杏酸降解率均呈先升后降的趨勢，當接種量處于1.5%的條件下，黃酮含量、菌量變化、銀杏酸降解率處于較低水平，這是因為最初時刻的接種量過低，發酵時間長，混合益生菌增長緩慢；當接種量處于5%的條件下，三角瓶中的營養物質含量有限，混合益生菌數量先增多，而后受到抑制，其次發酵產物迅速積累，發酵產物銀杏酸等有毒物質來不及降解而發生堆積現象，可能抑制菌量增長，影響發酵中混合益生菌的數量，從而影響發酵中的黃酮含量變化以及降低銀杏酸降解率。因此，選取接種量為2%、3.5%、5%進行下一步優化。

圖5 接種量對銀杏葉發酵中菌量變化和銀杏酸降解率的影響

圖6 接種量對銀杏葉發酵中菌量變化和黃酮含量變化率的影響

2.1.3 發酵時間對黃酮、菌液、銀杏酸含量變化的影響 由圖7、圖8可知，隨著發酵時間的延長，銀杏葉藥渣發酵中的菌量變化和黃酮含量變化、銀杏酸降解率也呈現先升后平緩再降低趨勢。在發酵15 h前，發酵時間短，混合益生菌最佳活力未被激活，而導致發酵不完全，銀杏葉藥渣中的物質未被充分發酵分解，各項指標呈現增長趨勢；在發酵15 h后，混合益生菌菌量、黃酮含量、銀杏酸降解率達到最大；發酵時間在15～18 h時，指標達到穩定；在發酵18 h后，銀杏葉藥渣發酵中的菌量變化和黃酮含量變化、銀杏酸降解率開始呈現降低趨勢，隨著時間的增長，菌量受到發酵中成分的影響，達到最大值，發酵過程產生大量未降解的產物及銀杏酸等有毒物質，抑制益生菌群的生長，導致益生菌菌株生長受到限制，進而影響銀杏酸降解率、黃酮含量變化。因此，選12、15、18 h進行下一步的優化。2.2響應面優化試驗結果 在單因素結果基礎上，利用Box-Behnken試驗原理設計，以料液比（A）、接種量（B）和發酵時間（C）為自變量，以銀杏酸降解率和黃酮含量變化率為響應值，進行相對應的的響應面試驗設計（表2）。

圖7 發酵時間對銀杏葉發酵中菌量變化和以銀杏酸降解率的影響

圖8 發酵時間對銀杏葉發酵中菌量變化和黃酮含量變化率的影響

表2 響應面試驗原理設計方案及結果

2.2.1 回歸方程及方差分析 以黃酮含量變化率為響應值，分析見表3，處理后，得到回歸方程：Y1（黃酮含量變化率）=1.42+0.0675A-0.0112B+0.0263C-0.0075AB-0.0425AC-0.0050BC-0.0865A2-0.1690B2-0.0340C2。該回歸方程模型（P＜0.05，下同）顯著，失擬項不顯著（P＜0.05，下同），說明沒有產生失擬現象；R2為0.8774，表明在銀杏葉藥渣發酵過程中以黃酮含量變化率建立的模型與實際結果差異較小，擬合程度較高。調整系數R2為0.7198，說明該模型有71.98%響應值的變化可以解釋，可用于預測黃酮含量變化率的理論值。一次項A和二次項A2對銀杏葉藥渣發酵中的黃酮含量變化率有顯著影響（P＜0.05，下同），平方項B2對銀杏葉藥渣發酵中的黃酮含量變化率有極顯著影響（P＜0.01，下同），而一次項B、C和交互項以及平方項AB、AC、BC、C2對黃酮含量變化率影響不顯著。根據F值大小可知，各因素對銀杏葉藥渣發酵黃酮含量變化率的影響的排序為A＞C＞B，即料液比＞發酵時間＞接種量（陸冉冉等，2020）。

表3 以黃酮含量變化率為響應值方差分析

以銀杏酸降解率為響應值，分析見表4，處理后，得到回歸方程：Y2（銀杏酸降解率）=0.3469+0.0060A+0.0300B-0.0071C-0.0220AB+0.0016AC+0.0104BC-0.0505A2-0.0288B2-0.0516C2（劉其星等，2021）。該回歸方程模型顯著，失擬項不顯著，說明沒有產生失擬；R2為0.8826，表明在發酵過程中以銀杏酸降解率建立的模型與實際結果差異較小，擬合程度較高。調整系數R2為0.7316，說明該模型有73.16%響應值的變化可以解釋，可用于預測銀杏酸降解率的理論值。 一次項B對發酵中的銀杏酸降解率有顯著影響，二次項A2、C2對發酵中的銀杏酸降解率有極顯著影響，而一次項A、C和二次項以及平方項AB、AC、BC、B2對銀杏酸降解率影響不顯著。根據F值大小可知，各因素對發酵中銀杏酸降解率的影響的排序為B＞C＞A，即接種量＞發酵時間＞料液比（陸冉冉等，2020）。

表4 以銀杏酸降解率為響應值的方差分析

2.2.2 響應面圖結果分析 由圖9、10、11可知，料液比與接種量對黃酮含量變化率、接種量與發酵時間對銀杏酸含量變化率、料液比與發酵時間對銀杏酸降解率之間都對混合益生菌發酵銀杏葉藥渣中黃酮含量變化率、銀杏酸降解率存在一定的交互作用影響，最佳預測點在試驗范圍內，該模型的擬合度較高，可以較準確的描述料液比、混合益生菌接種量、發酵時間與試驗結論之間的關系。韓瑨等（2017）提出響應面曲線變化幅度越大，對于操作條件的改變影響就越大。由圖10可見，三維圖表面最陡峭，可知A（接種量）與C（發酵時間）的交互作用對銀杏酸降解率影響最大。

圖1 蘆丁濃度標準曲線

圖9 料液比與接種量交互對黃酮含量變化率影響的響應面圖

圖10 接種量與發酵時間交互對銀杏酸降解率影響的響應面圖

2.2.3 驗證試驗結果 利用Design-Expert 12.0軟件預測混合益生菌發酵銀杏葉藥渣中黃酮含量變化率、銀杏酸降解率的最佳發酵工藝條件，經過分析，其最佳條件為料液比0.13 g/mL、接種量3.5%、發酵時間15 h，此時的銀杏葉藥渣發酵中銀杏酸降解率為34.69%，黃酮含量變化率為1.418。為驗證響應面回歸模型理論值的可行性，在料液比0.13 g/mL，接種量3.5%，發酵時間15 h條件下，進行平行試驗三次，發酵后相對于發酵前的黃酮含量變化率為1.407，銀杏酸含量降解了35.03%，與預測值相對誤差較小，說明通過響應面優化試驗得到的模型，具有一定的參考性，可以較為準確的反映出銀杏葉藥渣在混合益生菌發酵條件下中的黃酮含量變化率和銀杏酸降解率。

圖11 料液比與發酵時間交互對銀杏酸降解率影響的響應面圖

3 討論

目前，銀杏葉中黃酮的提取以及銀杏酸的降解工藝大多通過正交試驗進行優化，但目前仍存在發酵時間過長、黃酮得率較低、銀杏酸降解難等一系列問題。因此，研究一種回收率高，同時可以將銀杏葉藥渣中的可利用成分盡可能保存并且降低其中的銀杏酸等毒性成分含量的工藝逐漸成為現在的研究熱點。益生菌微生物發酵是近些年的研究熱點，利用一些具有安全性、益生作用的微生物發酵，不僅可以確保發酵過程的安全可靠，而且還有可能產生一些具有益生作用的物質。在本試驗中，通過響應面試驗模型，研究銀杏葉藥渣中料液比、接種量、發酵時間對黃酮含量變化率、銀杏酸降解率的影響；在單因素發酵時間影響的試驗中，銀杏酸降解率與李銀亮等（2013）研究的變化趨勢大體相似，可能是由于發酵前期銀杏酸含量較少，菌種活力較強，分解效率較高，隨著發酵時間的增加，銀杏黃酮的釋放伴隨著銀杏酸的析出，菌種效率指數逐漸達到最大值，此后銀杏酸開始堆積，銀杏酸的大量堆積可能會抑制菌種活力，從而銀杏酸降解率指標開始緩慢減少；通過響應面試驗模型，得到本試驗的最優條件為：料液比0.13 g/mL、接種量3.5%、發酵時間15 h，在此優化條件下，得到發酵過程中的黃酮含量變化率為140.7%，銀杏酸含量降解率35.03%，該值與理論值基本吻合，說明響應面優化得到的發酵工藝參數，具有一定的可行性。在解文利等（2020）的研究中，采用紫紅曲霉雙向發酵，通過正交試驗優化，在得到的最優條件下，總黃酮含量達到0.074 mg/mL，在本試驗中最優條件下，黃酮含量變化率為140.7%，最終得到的總黃酮含量為0.1790 mg/mL，效果較優，可能是由于發酵菌種為混合菌，種類繁多，混菌中存在著分解能力較好的菌種，從而使得對銀杏葉藥渣中未被充分利用的物質釋放出來，提高了黃酮含量，除此之外，本試驗黃酮含量提高了40.7%，也高于Qiu等（2014）研究中用漆酶發酵提升了24.11%；在任金玫等（2015）的研究中，發酵15 d后，有毒成分銀杏酸降解了44.6%，有效成分黃酮含量變化率為103.14%，本試驗的銀杏酸降解率與其基本一致，但黃酮含量變化率低，且發酵時間明顯長于本試驗，除此之外，該方法采用冠突散囊菌，只能用于生產，而不可食用，相比之下，本試驗發酵時間短，且所選菌種為益生菌，可食用，安全性較高。

由此可證明此法，可以大幅降低銀杏葉中有毒成分的比例，銀杏葉藥渣發酵物可以作為添加劑添加在蛋白飼料生產中，一方面提高了飼料中黃酮的含量，另一方面降低了銀杏酸等有毒成分的比例，為蛋白飼料的生產提供了有效的保障（鄭言等，2021）；除此之外，冉景盛等（2018）也將從銀杏葉中提取到的黃酮作為添加劑，添加到發酵乳飲料中，為銀杏葉發酵產物提供了新的應用方向；另外據相關醫學研究證明，銀杏葉黃酮還具有抗炎癥、抗酶活性等多種效用，它還可以用作藥品的生產研發（2021）；除此之外，銀杏葉中的黃酮具有抗炎癥的功能，并且具有天然性、無毒害、無耐藥性等特點，在飼料生產中，可作為添加劑代替在飼料生產中大量使用的抗生素，但目前在這方面的研究仍處于試驗探索階段，需要在使用方法上進行進一步的科學研究探索。

4 結論

單因素試驗和響應面試驗雙優化得到發酵條件為料液比0.13 g/mL、接種量3.5 g/mL、發酵時間15 h，在該條件下發酵后的黃酮含量變化率以及銀杏酸降解率與預測值相對誤差較小，基本一致，驗證了該模型的可靠性，為銀杏葉藥渣發酵開發利用提供了有效的參考。