鼻內滴注與氣管滴注PM2.5建立大鼠急性肺損傷模型的比較研究*

張行行，趙 麓，孫欠欠，趙安東，周甜雨，王 川，劉繼平，王 斌

（陜西中醫藥大學，陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室，陜西 咸陽 712046）

細顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）是指空氣動力學直徑小于2.5 μm的大氣顆粒物，是目前我國空氣污染物的主要組成。近年來空氣污染成為社會性熱點。由于PM2.5粒徑極小，可以經鼻腔、呼吸道而到達肺，一部分在上呼吸道和肺泡腔沉積引起肺部損傷和炎癥反應［1］，另一部分經肺循環進入全身血液，引起嚴重的心血管疾病［2］。相關研究表明，大氣中PM2.5水平與呼吸系統疾病發病率及死亡率密切相關，大氣中PM2.5濃度每增加10 μg/m3，哮喘病患者人數增加1.5%［3］；動物實驗結果也表明，急性或慢性暴露于PM2.5均能引發肺部炎癥［4-5］。因此，PM2.5對人體健康的危害程度遠大于其他粒徑較大的顆粒物，也成為一個研究熱點，使得高效、簡易、計量準確的造模方法成為研究該領域的迫切需要。

氣道染毒是構建肺部損傷模型、研究呼吸系統疾病的重要手段，而目前氣道染毒沒有統一的方式，常用的氣道給藥方式包括暴露式氣管滴注、非暴露式氣管滴注和鼻內滴注［6］。通過這3種方式給予PM2.5均能造成肺損傷，但暴露式氣管滴注需暴露組織，且適用于單次染毒，故不在本次實驗研究范圍。非暴露式氣管滴注通過氣管插管將PM2.5混懸液直接注射入肺腔導致肺損傷，而鼻內滴注利用重力和大鼠呼吸吸入使PM2.5到達肺部而引起肺損傷。因此，本課題組擬通過對比這2種方式給予相同劑量PM2.5混懸液對大鼠Th2應答影響，為研究呼吸系統疾病染毒方式的選擇提供參考。

材料和方法

1 動物

24只SPF級SD大鼠，雄性，（220±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司［許可證號為SCXK（川）2020-030］，飼養于陜西中醫藥大學中藥藥理實驗動物房內，溫度23～25℃，相對濕度45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應性飼養1周。實驗過程中對動物的處置符合《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892－2018）、《關于善待實驗動物的指導性意見》及陜西中醫藥大學倫理委員會規定和相關管理條例。

2 主要試劑和儀器

白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA試劑盒，以及酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）標準比色試劑盒均購于武漢博士德生物科技有限公司；IL-17和TGF-β抗體均購于武漢賽維爾生物科技有限公司；HE染液購于南昌雨露實驗器材有限公司；RNA提取、反轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒均購于均購自TaKaRa；戊巴比妥鈉購于天津蘭洪新能源科技有限公司。

DNP-9052恒溫箱（上海精宏試驗設備有限公司）；PW-812洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司）；SH01D高速離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）；XH-C漩渦混合器（江蘇大唐醫療器械有限公司）；Multiskan FC酶標儀（Thermo Fisher）；TH-1000CⅡ智能大流量空氣顆粒采樣器（武漢市天虹儀表有限責任公司）；Scientz-10N型真空冷凍干燥機（寧波新藝生物科技股份有限公司）；TKY-TKB攤片烤片機（湖北泰康醫療設備有限公司）；RM2235石蠟切片機（Leica）；BX53光學顯微鏡（Olumpus）；XMP102H型超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；UPHW-Ⅱ-90T超純水機（成都超純科技有限公司）；Exicycler 96實時熒光定量PCR儀（Bioneer）。

3 PM2.5的采集與處理

于陜西中醫藥大學四號教學樓樓頂，使用天虹大流量采樣器采集大氣PM2.5于玻璃纖維膜上，采樣高度為20 m。將載有PM2.5的玻璃纖維膜剪掉邊緣部分，裁剪為1 cm×1 cm大小，分裝于50 mL離心管中，加入純水至40 mL，低溫超聲震蕩60 min，將PM2.5洗脫，1 800目篩過濾，濾液真空冷凍干燥，4℃保存備用。臨用前，稱取適量PM2.5溶于生理鹽水，配成50 g/L混懸液，紫外燈下照射30 min。

4 方法

4.1 氣管滴注操作方法將19G號灌胃器針頭處磨平至圓滑，與1 mL醫用注射器組成進樣器，乙醚麻醉大鼠后（麻醉深度以用有齒鑷捏夾大鼠皮膚或腳趾無收縮反應為準），迅速呈仰臥位固定于自制鼠板上，四肢和上切牙均用橡皮筋固定，直立鼠板，使大鼠頭部朝上垂直于桌面，用組織鑷將大鼠舌頭向嘴角一側拉出口腔直至感覺阻力，插入可視采耳棒，調整角度，使大鼠口腔環境呈現于手機或其他智能設備上，再插入進樣器，使灌胃器針頭部插入氣管口1 cm左右，緩慢推注所需劑量PM2.5混懸液，滴注完成后立即拔出插管，保持大鼠直立，并輕輕左右晃動5 s，使混懸液擴散均勻，大鼠呼吸帶有濕啰音說明滴注成功，放回鼠籠內待蘇醒。注射器量取所需PM2.5混懸液時，可額外抽取0.5 mL空氣，然后手指輕堵灌胃針口，將藥液甩至空氣底部，注入空氣可使滴注液向肺組織深處擴散。見圖1。

Figure 1.Operation process of unexposed tracheal instillation in rats.A：experimental equipment；B：a fixed rat；C：a view of the throat.圖1大鼠非暴露式氣管滴注操作過程

4.2 動物分組及給藥24只SD大鼠隨機分為對照組（control）、鼻內滴注組（nasal）和氣管滴注組（tracheal），每組8只。其中，nasal組大鼠無需麻醉，抓取固定大鼠后，用10～100 μL移液槍吸取200 μL/kg的PM 2.5混懸液（10 mg/kg），緩慢滴入大鼠鼻腔，使其自然吸入呼吸道進行染毒；tracheal組大鼠經乙醚麻醉后，按4.1所述方法滴注200 μL/kg的PM2.5混懸液（10 mg/kg）。滴注每3 d一次，共10次。

4.3 觀察一般情況觀察滴注期間各組大鼠活動、毛色、飲食和呼吸狀態，記錄大鼠體重、滴注量、所需時間（氣管滴注從開始麻醉算）、一次滴注成功率和終成功率。

4.4 血清中IL-6和TGF-β含量的測定末次染毒完成后，禁食12 h，大鼠麻醉后，腹主動脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液。采用ELISA檢測IL-6和TGF-β含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用酶標儀測定450 nm處的吸光度，繪制標準曲線，計算實際樣品中IL-6和TGFβ水平。

4.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中ACP、AKP和LDH活性的測定取血處死大鼠后，結扎左側支氣管，采用5 mL注射器分三次吸取10 mL預冷的PBS對大鼠右肺進行灌洗（回收率達80%為合格），4℃、3 000 r/min離心10 min，回收上清液，按照試劑盒操作步驟檢測各樣本中ACP、AKP和LDH活性。

4.6 肺組織病理學觀察收集完BALF后，取右上肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹脂封片，于光學顯微鏡下觀察病理變化。

4.7 肺組織中TGF-β和IL-17蛋白表達的檢測取肺組織蠟塊，在二甲苯溶液中脫蠟，并在梯度遞減的乙醇溶液中水化，然后用檸檬酸鹽抗原修復溶液處理切片，用0.5% Triton X-100溶液透化20 min，用3%H2O2溶液孵育，5%牛血清白蛋白封閉20 min，再與IL-17和TGF-β抗體（1∶500）37℃下溫育1 h，PBS洗滌后，將切片與羊抗兔IgG（1∶1 000）在37℃溫育20 min，經DAB顯色、復染、脫水、透化、固定后，顯微鏡下觀察，并封片、拍照，以ImageJ軟件測定平均積分吸光度。

4.8 肺組織中IL-17和叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，Foxp3）mRNA表達的測定取各大鼠余下肺組織，TRIzol試劑提取大鼠肺組織總RNA，紫外分光光度測定RNA濃度及鑒定純度；PrimeScript RT kit將0.5 μg總RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，用Exicycler 96實時熒光定量PCR儀檢測mRNA表達。以β-actin為內參照，用2-ΔΔCt法計算IL-17和Foxp3的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The primer sequences

5 統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析；兩兩比較，數據方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane T2法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況

滴注過程中，control組大鼠毛色、飲食和行動正常，呼吸順暢平穩，無其他明顯異常狀態；nasal組和tracheal組大鼠在滴注4次后毛色變暗、呼吸急促、變得暴躁，且隨著染毒次數的增多，上述癥狀逐漸加重，但飲食未見明顯異常。3組大鼠體重增長情況良好，無顯著差異（P＞0.05）；nasal組和tracheal組大鼠滴注操作時間、一次成功率和終成功率見表2。滴注過程中，鼻內滴注組4號死亡，解剖發現肺部病變，但不能確定具體死因。

表2 滴注過程中大鼠一般情況Table 2.General conditions of rats during instillation（Mean±SD）

2 肺組織病理學觀察

HE染色結果顯示，control組大鼠肺組織結構完整清晰，肺泡腔內無滲出物，肺間質無水腫，肺泡間隔均勻且光滑，未見明顯的病理變化和炎性細胞浸潤；與control組相比，nasal組大鼠肺組織部分肺泡結構被破壞，伴有程度不一的萎縮及擴張，腔內可見少量炎癥細胞及紅細胞浸潤；tracheal組大鼠肺組織可見肺泡結構明顯破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺水腫、肺出血，以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內大量浸潤，肺部正常的組織形態結構消失，提示tracheal組大鼠肺部損傷較nasal組更為嚴重，見圖2。

Figure 2.Histopathological examination of SD rat lungs（HE staining，×100）.A：control group；B：nasal group；C：tracheal group.圖2 SD大鼠肺組織病理學檢查

3 BALF中ACP、AKP和LDH活性

與control組 比 較，nasal組 和tracheal組 大 鼠BALF中的ACP、AKP和LDH活性均顯著升高（P＜0.05）；兩種不同部位滴注相比，tracheal組大鼠BALF中ACP活性顯著較nasal組高（P＜0.05），但AKP和LDH活性無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

4 血清中IL-6和TGF-β含量

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠血清IL-6含量顯著升高，TGF-β含量顯著下降（P＜0.05）；兩組不同部位滴注組相比，tracheal組大鼠血清IL-6含量顯著較nasal組高（P＜0.05），但TGF-β含量無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 3.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the activity of ACP，AKP and LDH in BALF of rats.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖3鼻內滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對大鼠BALF中ACP、AKP和LDH活性的影響

Figure 4.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the serum levels of IL-6 and TGF-β in rats.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖4鼻內滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對大鼠血清中IL-6和TGF-β含量的影響

5 肺組織IL-17和TGF-β的蛋白表達

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠肺組織中IL-17蛋白表達顯著升高，TGF-β蛋白表達顯著下降（P＜0.05）；兩組不同部位滴注組相比，IL-17蛋白表達無顯著差異（P＞0.05），tracheal組TGF-β蛋白表達較nasal組顯著下降（P＜0.05），見圖5。

6 肺組織IL-17和Foxp3的mRNA表達

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達量和Th17/Treg比值顯著升高（P＜0.05），Foxp3 mRNA表達量顯著下降（P＜0.05）；與nasal組相比，tracheal組大鼠肺組織中IL-17和Foxp3的mRNA表達分別有升高和下降的趨勢，但無顯著差異（P＞0.05），Th17/Treg比值顯著升高（P＜0.05），見圖6。

討 論

近些年來，多位研究者相繼建立了多種氣道染毒方法，主要包括暴露式氣管滴注、非暴露式氣管滴注和鼻內滴注。暴露式氣管滴注需要分離頸部皮肉，利用醫用注射器直接將藥液注射入氣管，成功率高，劑量準確，但易造成感染，有少量死亡，且適用于單次染毒；非暴露式氣管滴注需要將大鼠麻醉，通過氣管插管將滴注液輸送到肺部，無需手術切口暴露氣管，染毒劑量準確且對實驗動物傷害較小，可進行多次染毒，但一般需要光纖、喉鏡、頭戴式放大鏡、內窺鏡等特殊設備，部分儀器價格過高，且對操作者的技能要求較高；鼻內滴注通過采用移液槍或小量程注射器將藥液液滴緩慢滴至鼻腔，利用重力和大鼠呼吸吸入，模擬了正常呼吸途徑染毒，但操作過程耗力，大鼠噴出引起劑量不準確，且多次染毒后，易造成鼻腔腫脹，大鼠變得脾氣暴躁，操作難度加大。因此，本實驗選擇能長期多次滴注的非暴露式氣管滴注和鼻內滴注，開展兩種滴注方式構建的肺損傷模型的比較研究，對研究PM2.5損傷呼吸道疾病提供參考。在本次實驗中，隨著滴注時間的延長，nasal組大鼠鼻腔開始腫大，性情狂躁，且因體型增大，在只用手抓取固定過程中，大鼠掙扎，難以控制。而tracheal組，待操作人熟練了后，麻醉后從固定到插管滴注只需要十幾秒，大多數時間花費在大鼠的麻醉上，但麻醉過程乙醚濃度過高，易引起大鼠呼吸衰竭和循環障礙，造成死亡，需把握好乙醚濃度和麻醉時間。

多項研究表明，PM2.5隨呼吸進入呼吸道和肺部以后，可在呼吸道沉淀積累，通過氧化應激或炎癥損傷等機制破壞肺泡腔血管基底膜和毛細血管膜結構，改變肺泡細胞膜形態結構和功能，增加細胞膜通透性，導致細胞內各種蛋白酶等內容物漏出［7］。通過檢測BALF中的ACP、AKP和LDH水平，可反映肺組織細胞膜受損程度［8］。本次實驗中，相較于control組，nasal組和tracheal組BALF中ACP、AKP和LDH活性顯著增加，這表明兩種滴注組大鼠肺部結構破壞，肺組織細胞膜通透性增加。肺組織病理學觀察也顯示肺泡結構被破壞，肺間質明顯增厚，大量炎癥細胞浸潤，亦表明該染毒組大鼠肺部出現了嚴重的病理損傷。但兩種染毒組大鼠肺損傷程度存在一定差異，tracheal組大鼠肺損傷程度較nasal組更為明顯，推測是鼻內滴注過程中，鼻腔內黏膜組織吸附了一部分的顆粒物，使實際進入到肺組織的顆粒物減少，這也致使了該組大鼠鼻腔腫脹，但此方法模擬了正常呼吸道發病過程，而氣管滴注是直接將PM2.5混懸液送至氣道，到達肺組織，沒有經過從鼻、呼吸道到肺的過程，損傷更為顯著。

Figure 5.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the protein expression of IL-17 and TGF-β in rat lung tissues（immunohistochemical staining，scale bar=20 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖5鼻內滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對大鼠肺組織IL-17和TGF-β蛋白表達的影響

Figure 6.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the mRNA expression of IL-17 and Foxp3 in rat lung tissues.A：the mRNA expression of IL-17；B：the mRNA expression of Foxp3；C：the ratio of IL-17（representing Th17 cells）/Foxp3（representing Treg cells）.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖6鼻內滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對大鼠肺組織IL-17和Foxp3 mRNA表達的影響

Th17和Treg均由CD4+T淋巴細胞分化而來，在正常條件下，Th17和Treg的動態平衡調節體內自身免疫，而在肺損傷等呼吸系統炎癥性疾病的發生發展過程中均發現伴隨Th17/Treg平衡的失調［9］。Th17細胞可以釋放IL-17，促進T細胞增殖和IL-6等炎癥介質的表達，增強Th2應答；而Treg細胞主要通過分泌抗炎細胞因子發揮免疫抑制作用，并可與Th17細胞相互拮抗。Foxp3是識別Treg細胞的常規標志物，是Treg細胞分化和表達功能的關鍵因子，可通過分泌TGF-β等抑炎因子，減輕炎癥浸潤，促進病毒清除，避免過度非特異免疫應答，抑制Th2應答，在抵抗胞外病原體入侵和抑制自身免疫中起著保護作用［10-12］。本次實驗結果表明，相較于control組，nasal組和tracheal組大鼠血清中IL-6和TGF-β含量顯著升高；肺組織中IL-17的蛋白和mRNA表達及Th17/Treg比值顯著升高，TGF-β蛋白和Foxp3 mRNA表達量顯著下降，提示兩種方式滴注PM2.5混懸液均能引起肺部炎癥反應，加強Th2應答；但兩種滴注方式相比，tracheal組大鼠血清中IL-6表達量和肺組織中Th17/Treg比值較nasal組顯著升高，TGF-β蛋白表達降低，其余指標無顯著差異。

綜上所述，鼻內滴注和氣管滴注PM2.5混懸液均能增加肺泡細胞膜和肺泡上皮-毛細血管膜通透性，導致細胞內各種蛋白酶等內容物漏出，對肺泡細胞產生毒作用；此外，還可增加促炎細胞因子的產生，使Th17/Treg比值升高，加強Th2應答，導致肺部炎癥損傷，進一步促進肺部損傷或肺部乃至多器官的衰竭。兩種滴注方式相比，本研究所采用的利用可視挖耳勺代替內窺鏡的氣管內滴注法具有劑量準確、可視等優點，所構建的模型大鼠肺損傷更加明顯，但忽略了ALI正常發病過程；鼻內滴注法具有無需麻醉、易上手、無需借助其他工具、模擬了ALI正常發展過程等優點，但對操作者較為耗費精力，且劑量不準確。兩種滴注方式具體在劑量和時間上對大鼠肺組織損傷影響的差異，還需進一步研究。