酵素釀造過程中乳酸強化發酵工藝研究

曹剛剛，冀利峰，徐芳芳，李宣衡，曾化偉

（1.安徽養生天下生物科技有限公司，安徽亳州 236831；2.淮北師范大學生命科學學院，安徽淮北 235000）

食用酵素是采用動物、植物、菌類等作為原料，經過微生物發酵產生的具有多種生物活性成分的對人體健康有益的發酵食品[1]。酵素的產品形式多樣，包括液體、粉體、膏體、顆粒、片劑、膠囊等[2]。固體酵素產品多經液態發酵，經過噴霧或者冷凍干燥獲得酵素粉，再經過不同的工藝加工成各種產品[3]。

酵素發酵是一個微生物共生的系統，涉及酵母、乳酸菌和醋酸菌等多種菌種[4]，因此是一個復雜的微生物共生系統[5-7]。醋桿菌屬（Acetobacter）的細菌常出現在花、果、蜜蜂、葡萄酒、蘋果酒、醋、“紅茶菌”及“納豆”中[8-11]，為非運動性的專性好氧性細菌，能在2%～11%醋酸的強酸性條件下氧化乙醇產生醋酸[12]。醋酸桿菌與醋酸發酵中的有機酸等揮發性風味物質的動態變化有關，對于風味物質的形成至關重要[13-16]。研究報道在鎮江香醋固態發酵過程中，醋酸桿菌與56 種風味的產生相關，和乙酸-2-苯乙酯、糠醛、苯甲醛、3 -羥基-2 -丁酮和3 -乙酸-2 -丁酮含量呈正相關，也與揮發性酯類、雜環芳香物、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸含量的變化有關[17]。乳桿菌屬（Lactobacillus）廣泛應用于食品發酵，除能產生乳酸及改善產品風味及質構外[18-20]，還能產生潛在降膽固醇、抗糖尿病、抗氧化和免疫調節功能的代謝產物及胞外多糖[21]。“后生元”指的是益生菌經加工處理后的益生菌代謝物成分統稱，包括菌體與代謝產物[22]。事實上，一些乳桿菌即使被滅活也能發揮促進健康的作用。這些化合物包括改善乳糖消化的β -半乳糖苷酶、γ -氨基丁酸、共軛亞油酸、生物活性肽、酚類化合物等[23]。

酵素釀造過程中，乳酸菌發酵并且積累乳酸是這個發酵工藝的核心關鍵，對產品成分、產品風味和發酵進程都有顯著影響[24-26]。如果乳酸菌不能在合適條件下深度發酵，勢必造成底物大量發酵轉化為乙醇，進而轉化為乙酸，造成醋酸大量積累，導致最終產品總酸過高，而且乙酸占比過高[27]。產品風味尖酸刺激，感官體驗差。因此，選擇多種原料和培養基質，模擬不同的發酵條件（不同溫度、通風條件、接種程序）進行發酵過程的監控，以期建立乳酸強化、總酸降低、風味優良的酵素發酵工藝。

1 材料和方法

1.1 材料

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae（市售）、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum（實驗室貯藏）、巴斯德醋酸桿菌Acetobacter pasteurianus（實驗室貯藏）；蘋果、梨、黃瓜、胡蘿卜、山楂，均為市售。

葡萄糖、磷酸、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞等，分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供；乙腈、甲醇、冰乙酸，均為色譜純，DL-乳酸AR（85%～90%），上海麥克林生化科技有限公司提供。

DNS 試劑：稱取3,5 -二硝基水楊酸10 g，置于600 mL 水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50 ℃水浴中磁力攪拌溶解，再依次加入酒石酸甲鈉200 g、重蒸苯酚2 g 和無水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d 后使用。

1.2 培養基

（1）酵母菌種子培養基。葡萄糖10 g/L，新鮮馬鈴薯200 g/L。

（2）醋酸菌種子培養基。葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L、pH 值5.5。

（3）植物乳桿菌培養基（標準培養基）。蛋白陳10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水至1 000 mL。校正pH 值6.2，分裝后于121 ℃下高壓滅菌15～20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 殘糖的測定

配制不同質量濃度的葡萄糖標準溶液，與DNS試劑反應，繪制標準曲線。

樣品液適當稀釋，使糖質量濃度為0.1～1.0 mg/mL，取稀釋后的糖液1.0 mL 于15 mL 刻度試管中，加DNS 試劑2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷卻后用水補足到15 mL 刻度，于波長540 nm 處測定光密度。從標準曲線查出葡萄糖數（mg/mL），根據稀釋倍數計算出樣品中糖含量。

1.3.2 生物量的測定

菌體生長的測定：吸取0.2 mL 待測液，加入0.25 mol/L HCl 溶液或蒸餾水5 mL，于波長600 nm處測光密度值，OD 值與菌體干重和活菌數均有一定的相關性。因此，OD 值是一種十分簡便的表示菌體生長狀況的參數。

1.3.3 總酸含量的測定

取發酵液1 mL，用去離子水稀釋10 倍，以0.1%酚酞為指示劑，0.10 mol/L NaOH 滴定至變色，計算總酸含量（以乳酸計）。

1.3.4 有機酸含量的測定

（1）色譜條件。Waters UPLC 超高效液相色譜儀，色譜分離柱：Waters AQ-C18色譜柱（1.9 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相A：乙腈；流動相B：20 mmol/L pH 值2.2 磷酸鹽緩沖液；柱溫40 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量為10 μL；紫外檢測器檢測波長210 nm。

流動相組成見表1。

表1 流動相組成

（2）超高效液相檢測樣品的制備。取酵素樣品1.5 mL，經0.22 μm 濾膜過濾處理后，裝入標記好的進樣瓶備用。

（3）外標工作曲線的確定。

外標工作曲線見表2。

表2 外標工作曲線

2 結果與分析

2.1 不同條件下植物乳桿菌純培養情況

不同培養條件下植物乳桿菌純培養結果見圖1。

圖1 不同培養條件下植物乳桿菌純培養結果

由圖1 可知，植物乳桿菌在12 h 后進入對數生長期，在30 ℃下培養的生物量高于37 ℃。不同溶氧條件下生物量沒有顯著差異，由于植物乳桿菌為兼性厭氧型乳酸菌。因此說明在靜置發酵體系和有攪拌通風的發酵體系中，都可以進行發酵積累乳酸。與生物量相反的是，37 ℃培養相比30 ℃培養乳酸的積累量更多，但差距不大。同樣溫度條件下，靜置培養比搖瓶培養更有利于乳酸發酵。考慮到酵素釀造的實際情況及能耗等，優先選擇30 ℃作為后續發酵條件。

2.2 采用標準培養基不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量情況

在明確了植物乳桿菌的發酵條件的基礎上，進一步研究不同工藝條件下，3 種典型酵素釀造微生物協同發酵的不同工藝。

項目中比較的幾種混合菌種發酵工藝見表3。

表3 項目中比較的幾種混合菌種發酵工藝

以實驗室標準培養基為基質不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量見圖2。

圖2 以實驗室標準培養基為基質不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量

由圖2 可知，工藝1 和工藝2 的產酸水平最高，其中工藝2 的總酸含量最高，達到22.6 g/L。工藝1的總酸中乙酸占比達到60%且乳酸含量較低，醋味重，感官刺激性較強，風味不協調。工藝3、工藝4、工藝5 均采用第二或者第三階段接種醋酸菌，此三者產酸水平均較低，不足15 g/L。尤其是工藝4，總酸中乳酸占比最低，風味也最差。

工藝2、工藝3 及工藝5 的乳酸占比較高。這3 種工藝的共同點是在第一階段接種植物乳桿菌。推測起始培養基中營養豐富，含有蛋白胨等營養物質較多，各微生物生長較好，尤其植物乳桿菌生長和積累乳酸的量都較多。

5 種發酵工藝的殘糖都不多，范圍在0.1～1.4 g/L。由圖2 可見在發酵后期接種醋酸菌有利于培養基中碳水化合物的完全利用。工藝2 采用了2 次接種植物乳桿菌，殘糖含量最低。

2.3 以混合果蔬汁為基質的不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量

采用原料比例為蘋果、梨、黃瓜、胡蘿卜、山楂的質量比例為3∶2∶1∶3∶1，打漿后按照30%的質量分數加水稀釋，加入適量葡萄糖調整果蔬汁的糖度至10 °Brix，發酵總時間為10 d。

可以發現，在植物性原料中，由于蛋白質等營養物質較少，結果與標準培養基差距顯著。采用果蔬汁作為主要發酵基質，5 種工藝產酸水平都更高。同樣，工藝1 和工藝2 總酸相對更高，但是總酸中乳酸的占比相較標準培養基更低，發酵液刺激性更強，風味不佳。但是工藝5，既在發酵前期接種乳酸菌可以強化乳酸發酵，后期再依次進行酵母和醋酸菌發酵的工藝會顯著提高發酵液中乳酸的含量，發酵液的氣味和感官品質最佳。

以混合果蔬汁為基質在不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量見圖3。

圖3 以混合果蔬汁為基質在不同混菌發酵工藝下總酸、乳酸、乙酸和殘糖含量

3 結論

酵素發酵制備過程涉及多種微生物，產生多種對產品感官風味有影響的有機酸、醇類、氨基酸和酯類[28]，特別是有機酸的含量和組成，對于酵素的感官品質起著至關重要的作用，酵素發酵通常會產生草酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、乳酸[29]。對于人體來說，乳酸是機體正常代謝過程中產生的代謝物，從外界攝入適量的乳酸能夠刺激胃液分泌，促進腸道蠕動，避免體內毒素堆積，抑制有害菌生長，維持腸道菌群的平衡[30]。蘋果酸能夠參與人體新陳代謝和能量轉化，有助于代謝的正常運行，可以促進營養物質在人體內吸收與代謝，包括乙酸、丙酸在內的短鏈脂肪酸，對人體腸黏膜屏障的維持、腸道動力的調節、免疫調節及抗腫瘤效應等具有重要作用，對腸道疾病的預防與治療有十分重要的研究價值[31]。

通過研究了不同的工藝條件對酵素發酵感官品質的影響，特別是有機酸的變化，發現不同的溫度，即30 ℃和37 ℃發酵，對生物量和發酵產酸影響較小，靜置發酵相對搖瓶發酵更有利于發酵產酸，同樣對生物量和有機酸的組成影響較小，實際發酵過程為保證發酵體系均勻，可以采用間歇振蕩的方式，發酵接種工序的設置是造成有機酸組成變化的最大影響因素，也導致酵素風味的巨大改變，5 種發酵工藝中，工藝1 和工藝2 在發酵第一階段接種醋酸菌，發酵產總酸最多，但是風味不佳；工藝3 和工藝5均在第一階段接種植物乳桿菌，發酵總酸相對較少而乳酸比例較高，其中工藝1 總酸最高而乳酸占比最低，風味刺激性最差，工藝5 總酸最低而乳酸含量最高，乳酸的占比也最高，味道豐滿、厚重、刺激感較少。

在酵素的實際生產中，第一階段接種植物乳桿菌進行乳酸發酵對無菌環境要求較高，容易染菌，需要在操作和原料滅菌的環節提高操作水平和無菌程度，需要制定詳細的操作規范。接種醋酸菌的功能之一在于轉化無氧發酵產生的乙醇，但是醋酸菌的代謝活動會消耗乳酸，因此乳酸菌發酵積累的乳酸保持到發酵結束需要在一定程度上壓制醋酸菌的代謝活力[32]。在發酵控制上可以通過營養和環境條件進行有效控制，相關的詳細工藝條件還需進一步深入研究。